刘 茜

（贵阳康养职业大学，贵州 贵阳 550001）

近年来随着我国人口老龄化速度的加快，各类基础疾病的发病率均逐年增加，其中就包括肾病[1]。目前，临床上一般是对肾组织样本实施冰冻切片免疫荧光染色诊断或石蜡切片免疫荧光染色诊断，或将二者联合应用。临床一般认为冰冻切片免疫荧光染色法的诊断效果相对较佳，但也存在一定不足，如该方法对于检测样本的要求苛刻，在运输、保存等环节稍有不慎就可影响最终的诊断结果（哪怕只是温度稍高即可造成影响）[2]。另外，冰冻组织的细胞结构清晰度、完整性也欠佳，在某些情况下一个样本可以得出多个互相矛盾的诊断结果。而石蜡切片则是临床上为改善冰冻切片进行的一种尝试。早期临床认为基于福尔马林固定的石蜡切片不适合开展免疫荧光染色，因为在固定的过程二价钙离子与其他二价离子会影响抗原，可能使抗原无法充分暴露，导致免疫荧光特异性减弱[3]。因此，在早期石蜡切片固定并不被作为活检的主要手段，其更多的是辅助冰冻切片方案进行更高精度的诊断，尽管研究证实两种方案的效能相近[4]。近年来随着针对免疫荧光染色法的进一步研究，一些新的、特殊的染色方案被提出，石蜡切片造成的免疫荧光特异性减弱的问题得以改善，理论上其可以提供更为有效的诊断效能。基于此，本研究以2021 年1 月至2022 年12 月进行病理学肾组织活检的83 例患者为研究对象，探讨肾活检组织病理诊断中应用新式石蜡切片免疫荧光染色法的可行性与效能，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

研究开展的时间为2021 年1 月至2022 年12 月，共纳入83 份肾组织样本，其中10 份来源于贵州电力医院，73 份来源于贵州医科大学附属医院。对全部样本均实施常规冰冻切片免疫荧光染色诊断与新式石蜡切片免疫荧光染色诊断，将前者列为冰冻组，将后者列为石蜡组。83 份肾组织样本来源于83 例患者，其中男51 例，女32 例，年龄范围45 ～68 岁，均值（55.31±3.96）岁；其中膜性肾病23 例，狼疮性肾病30 例，IgA 肾病30 例。病例纳入标准：（1）临床资料完整，并签署知情同意书；（2）经耐受性评估符合肾穿刺活检指征。病例排除标准：（1）存在认知功能障碍或合并精神疾病；（2）合并严重感染，或伴有其他置管支持治疗措施，如维持性血液透析；（3）存在严重的肝、肾功能障碍；（4）不耐受肾穿刺活检或拒绝行肾穿刺活检。

1.2 方法

1.2.1 冰冻切片免疫荧光染色 对肾组织进行OCT 包埋，然后采用冰冻切片机切片，厚度为5 μm，干燥3 min 后保存。转移至实验室，在标本中加入异硫氰酸荧光素标记的兔抗人作为一抗，包括免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）及补体C3、补体C1q。将切片置于湿盒内，在37 ℃的恒温水浴锅中孵育45 ～60 min。用磷酸盐缓冲液浸洗5 min，反复浸洗3 次，最后直接进行荧光显微镜观察。

1.2.2 石蜡切片免疫荧光染色 对肾组织进行常规处理后使用3- 氨丙基-3- 乙氧基甲硅烷处理，预防脱片。脱蜡至水（2 次，单次20 min）后实施抗原修复，使用酸碱度为6.0 的柠檬酸为缓冲液，行微波加热修复，冷却为室温后实施胰酶消化。置于37 ℃的恒温水锅内消化15 min，然后配置六胺银染色，材料为：50 mL硼砂溶液+ 六次甲基四胺银粉剂。染色：将溶液放置于62 ℃温水箱中预热，将石蜡样本放入62 ℃六胺银中30 min，持续恒温下切片，出现黑色反应后捞出。采用蒸馏水冲洗，以硫代硫酸钠溶液处理3 min 后冲洗，采用Mayer 苏木素染液（上海虹桥试剂）染色5 min，冲洗3 min 后行脱水处理。以伊红染液（上海虹桥试剂）染色1 min，梯度酒精脱水，以二甲苯（天津市化学试剂供销公司）为透明剂，用中性树胶封固，后观察确认IgA、IgG、IgM 及补体C3、补体C1q 的阳性情况。

1.3 观察指标

观察并统计两种诊断方式对膜性肾病、狼疮性肾病、IgA 肾病患者IgA、IgM、IgG、补体C3、补体C1q 的阳性检出情况。

1.4 统计学方法

2 结果

肾病理组织活检的阳性检出结果显示，石蜡组23 例膜性肾病患者、30 例狼疮性肾病患者和30 例IgA 肾病患者IgA、IgM、IgG、补体C3、补体C1q 的阳性检出率均高于冰冻组，但两组仅在膜性肾病患者IgA、狼疮性肾病患者IgA、IgG、补体C1q 的检出率方面存在统计学差异（P＜0.05），其他组间对比均无统计学差异（P＞0.05）。详见表1。

表1 两种诊断方式诊断结果的比较[例（%）]

3 讨论

肾病在临床上的发生率较高，且此类疾病的诊治较为复杂，有超过半数的患者病情会持续进展[5]。这就需要临床准确判断肾病患者的疾病类型，以及其免疫反应的情况，实现明确诊断，以便及早开展针对性治疗，延缓患者病情的发展。由于肾病主要是肾小球、肾微血管及其他细微组织受损，因此影像学诊断的效果较差。此外，肾功能损伤又是一个缓慢的过程，因此早期通过生化标志物检测进行诊断的效果也一般。基于此，病理学诊断成为当下肾病最为准确的诊断方案。但由于肾组织的特殊性，加之其主要是通过观察免疫球蛋白等物质来进行疾病类型的鉴别与严重程度的判断，以及当下较为常用的冰冻切片免疫荧光染色法本身存在的缺陷，导致实际应用过程中病理学诊断仍然存在一定的不足[6]。石蜡切片免疫荧光染色法并不是针对肾活检病理学诊断的新方案，其发明已有较长时间，但临床认为石蜡固定样本会造成抗原封闭的问题，因此存在一定的局限性。近年来随着抗原修复技术的发展，已逐渐解决了石蜡固定导致抗原封闭的不足。目前，临床上常用的抗原修复方案包括微波、高压等，效果均较佳。另一问题是，石蜡固定会造成切片的非特异性荧光染色存在缺陷，易出现背景染色的现象，这是因为目前对于石蜡脱蜡的时间没有定论。但随着大量实验的开展，逐渐发现二次脱蜡以及20 min 左右的脱蜡时间较为理想，同时新式染色法也弥补了染色缺陷、背景染色的问题。得益于石蜡切片可以很好地保存组织结构，使其呈现较高的清晰度，因此理论上新式石蜡切片免疫荧光染色法的效能应该优于一般冰冻切片免疫荧光染色法。本研究结果显示，石蜡组23 例膜性肾病患者、30 例狼疮性肾病患者和30 例IgA 肾病患者IgA、IgM、IgG、补体C3、补体C1q 的阳性检出率均高于冰冻组，但两组仅在膜性肾病患者IgA、狼疮性肾病患者IgA、IgG、补体C1q 的检出率方面存在统计学差异（P＜0.05），其他组间对比均无统计学差异（P＞0.05）。该结果符合上述观点。笔者猜测导致该结果出现的原因主要有两点：一是行肾组织穿刺活检时，为了减轻损伤，一般只会采集较小的样本，传统冰冻切片免疫荧光染色法受制于各种因素的影响，只能观察一个或几个肾小球，并不能很好地判断肾组织的具体情况，且冰冻切片必须在穿刺后的一定时间内完成，否则样本就会发生自溶，实际上处理样本的时间可能不足；二是新式石蜡切片免疫荧光染色法可以观察肾小球系膜区域，了解基膜的变化，理论上观察范围与角度均大于传统冰冻切片免疫荧光染色法，另外石蜡切片可以很好地保存组织结构，降低观察的难度，提高观察的准确性。

综上所述，在肾病患者肾组织病理活检诊断中，新式石蜡切片免疫荧光染色法的诊断效能优于传统冰冻切片免疫荧光染色法，有助于更为准确地检出不同类型的肾病，具有较高的临床应用价值。