马 娟, 余 扬, 于 扬, 张 波, 董祥林

(新疆医科大学第一附属医院整形科, 乌鲁木齐 830054)

增生性瘢痕(Hypertrophic scar, HS)的组织学特征为成纤维细胞(Fibroblast,FB)过度增生和细胞外基质( Extracellular matrix,ECM) 过度沉积,属于皮肤纤维增生性疾病[1-3],但增生性瘢痕的形成机制尚未完全明确。目前对其预防和治疗策略主要分为:非手术治疗包括外用硅酮凝胶贴片[4]、外用皮质类固醇贴剂、瘢痕内注射皮质类固醇[5]、瘢痕内注射5-氟尿嘧啶[6]、口服药物(如普萘洛尔和氧甲氢龙)[7];手术治疗包括手术切除、松解瘢痕等。虽然瘢痕治疗的方式种类繁多,但治疗多停留于功能层面,患者即使功能得以恢复,因瘢痕存在对容貌的损害和心理的负面影响,仍无法回归正常的工作和生活。如何将预防与治疗达到功能和美观并重,促进患者回归正常生活、提高生活质量是进一步努力的方向[8]。转化生长因子β1(TGF-β1)是已明确可诱导体内纤维化反应的重要转化生长因子,其表达增强是病理性瘢痕产生的重要原因,蛋白激酶(MAPK)通路是其下游的非典型通路,p38/MAPK是其中一个通路[9]。有研究显示p38/ MAPK通路的激活与肾纤维化相关,在小鼠单侧输尿管梗阻(UUO)模型和人IgA肾病活检标本中观察到磷酸化的p38(P-p38)与肾小管间质纤维化密切相关,抑制p38/ MAPK可防止肾纤维化的进展[10]。本课题组前期实验结果发现,A型肉毒毒素能够通过抑制ERK/MAPK信号通路而使得成纤维细胞凋亡增加,增殖活性减弱,Ⅰ型胶原蛋白分泌减少[11]。本研究分析BTXA对体外增生性瘢痕成纤维细胞的作用及对P38/MAPK通路的影响,探究BTXA抑制增生性瘢痕形成的作用机制,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2020年2月-2021年10月新疆医科大学第一附属医院整形科收治的12例增生性瘢痕患者手术切除的废用瘢痕组织,患者年龄7～45岁,男性4 例,女性8 例。所有患者临床及病理诊断均为增生性瘢痕,瘢痕处均未接受过其他治疗。本研究通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会审核,所以患者及监护人均签署知情同意书。

1.2 药物及试剂A型肉毒毒素(兰州衡力公司),p38MAPK抑制剂SB202190(北京索莱宝公司) , TGF-β1(Protech 公司),高糖DMEM (美国 Hyclone公司 ),胎牛血清(美国Gibco公司), 青链霉素双抗溶液(美国Hyclone公司),Collagen Ⅰ、p38/p-p38抗体(美国Abcam公司),羊抗兔二抗(美国Abcam公司)。

1.3 细胞培养采用组织块法进行原代培养,在无菌条件下获取手术切除的增生性瘢痕组织,去除组织表皮和脂肪,剩余组织进一步修剪成0.7×0.7 cm2大小的组织块,用含3%双抗的PBS漂洗3～5遍,以合适间距放入10 cm培养皿中,放入5%CO2,37℃培养箱固定2 h,待组织块贴壁后加入8～10 mL完全培养基(含10%FBS+1%双抗)。当培养基由粉红色转变为橙黄色或黄色,每3天换液1次,镜下观察待细胞爬出融合至85%～90%,即可将组织块移入新的培养皿内继续固定和培养,爬出的原代细胞用0.25%胰酶消化后继续传代培养。

1.4 CCK8试验取“1.3”项下培养的增生性成纤维细胞以80%的密度接种于96孔板,分为空白对照组(0 u/mL),2、4、8、10 u/mL BTXA5组[12],分别加入0、2、4、8、10 u/mL BTXA的培养基孵化24 h后,吸去原培养基,加入100 μL新鲜培养基,向每孔加入10 μL的CCK8试剂后,放入37℃培养箱内孵育2 h,用酶标仪测定450 nm处的吸光值。按公式:抑制率=[(OD空白对照组-OD实验组)]/OD空白对照组×100%计算不同药物浓度对成纤维细胞的抑制率。

1.5 细胞迁移能力-划痕实验取对数生长期的HSFbs细胞悬液以2.5×105个/孔的细胞密度接种于6孔板中,待细胞贴壁后镜下观察细胞均匀分布且生长密度达90%时,分别加入0、2、4、8、10 u/mL BTXA的培养基,用10 μL枪头行划痕试验,即时拍照,24 h后同一区域拍照,以ImageJ软件测量其划痕内空白面积,进行数据分析。

1.6 细胞因子检测-Western blot实验取对数生长期的HSFbs细胞悬液以2.5×105个/孔的细胞密度接种于6孔板中,待贴壁24 h后,吸去原培养基,将细胞分为:空白对照组(加完全培养基2.5 mL)、TGF-β1组(加入含TGF-β1浓度为5 ng/mL的培养基2.5 mL)、BTXA组(加入含BTXA浓度为8 u/mL的培养基2.5 mL)、TGF-β1+BTXA组(加入含TGF-β1浓度为5 ng/mL及BTXA浓度为8 u/mL的培养基2.5 mL) 、TGF-β1+SB202190 组(加入含TGF-β1浓度为5 ng/mL及SB202190浓度为3 μmol/L的培养基2.5 mL),其中细胞在加入p38抑制剂SB202190孵化2 h后再加入TGF-β1。放入37℃培养箱孵育24 h后,收集干预完毕的各组细胞,收集蛋白,以BCA 法测定蛋白浓度和均一化,行SDS-PAGE凝胶电泳,转膜,用5%脱脂奶粉封闭,加入一抗4℃过夜。加入二抗,室温孵育2 h后,化学发光法显影,使用Image J 软件分析条带灰度值,计算检测蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 CCK8试验结果与空白对照组比较,各浓度BTXA组成纤维细胞增殖均受到抑制,细胞增殖抑制率随BTXA的浓度升高而升高,差异有统计学意义(P<0.05),当BTXA浓度为8 u/mL时,其对增生性瘢痕成纤细胞的抑制率为59%,说明一半左右细胞被抑制,故选用8 u/mL的BTXA浓度进行后续试验,见表1。

表1 成纤维细胞增殖抑制率及划痕缺损面积

2.2 不同浓度BTXA培养基对增生性瘢痕成纤维细胞迁移能力的影响与空白对照组比较,4、8、10 u/mL BTXA组增生性瘢痕成纤维细胞迁移能力明显受到抑制,差异有统计学意义(P<0.05),且随着BTXA培养基浓度的增高,其对增生性瘢痕成纤维细胞迁移能力的抑制作用越明显,见表1。

2.3 BTXA对增生性瘢痕成纤维细胞中各种因子的影响与空白对照组比较,TGF-β1组可明显增强BCL-2及COL-1的表达, BTXA组可下调BCL-2及COL1的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。与TGF-β1组比较,TGF-β1+BTXA组与TGF-β1+SB202190组均可明显降低BCL-2及COL1的表达,差异有统计学意义(P<0.05),见表2、图1。

图1 HSFbs药物干预后COL-1、BCL-2的蛋白水平电泳图

表2 BTXA对增生性瘢痕成纤维细胞中各种因子的影响

2.4 BTXA对成纤维细胞中MAPK通路中P-p38的磷酸化产物变化影响与空白对照组比较,TGFβ1的P-p38明显升高,此差异具有统计学意义(P<0.05)。与空白组对照比较,BTXA 组的P-p38明显减低,此差异具有统计学意义(P<0.05)。以TGF-β1组作为阳性对照组,与TGF-β1组相比,TGF-β1+BTXA及TGF-β1+SB202190组的P-p38均明显降低,此差异具有统计学意义(P<0.01),见表2,图2。

图2 HSFbs药物干预后P38及P-p38蛋白水平电泳图

3 讨论

本研究发现BTXA对增生性成纤维细胞在形态、增殖、迁移方面有影响,BTXA可以明显抑制增生性成纤维细胞的增殖,并随着药物浓度增加对细胞的增殖抑制作用增强。Western blot显示BTXA能显著抑制I型胶原蛋白的生成,抑制BCL-2的合成。回蔷等[13]研究发现BTXA能够抑制HSFBs的增殖、转移能力,降低成纤维细胞中TGF-β1及其下游蛋白的表达形成。Zhou等[14]研究观察到内镜下注射BTXA可有效预防内镜下黏膜剥离术后食管狭窄,而刘晓鹤等[15]在对新西兰雄兔医源性急性热损伤后的前尿道局部注射BTXA溶液,发现其可减缓兔尿道狭窄的发生。以上研究显示BTXA在食管、尿道损伤后出现瘢痕纤维化改变造成的狭窄有缓解作用,这一结论与本研究结果一致。

本课题组前期试验结果显示BTXA通过MAPK通路可以起到抑制HSFbs的作用[16]。 MAPK包括ERK、p38和JNK 3个通路,目前关于BTXA抑制纤维化作用有通过ERK、JNK通路的研究,但P38MAPK通路暂无报道。根据既往研究,p38MAPK的活化产物 P-p38参与胶原合成,阻断p38通路时则阻止了胶原的mRNA表达。例如肝纤维化中,可观察到异鼠李素通过下调TGF-β1介导Smad3和p38/MAPK信号传导从而抑制ECM的形成[17]。本研究发现BTXA可抑制P-p38的表达,说明BTXA可抑制P38的磷酸化。TGF-β1可促进HSFbs中P-p38的表达,加入BTXA和P38抑制剂SB202190后,发现TGF-β1+BTXA组及TGF-β1+SB202190组的P-p38表达均低于TGF-β1组, 进一步说明BTXA可抑制p38的磷酸化过程,抑制P38/MAPK通路。

综上所述,BTXA通过抑制HSFbs的增殖及p38/MAPK通路的磷酸化,而负向影响BCL-2的表达并抑制COL1的生成,达到预防与治疗增生性瘢痕的作用。