刘海全，吴梅剑宗，蒙祖玉

1.广州中医药大学惠州医院骨科（广东惠州 516000）

2.惠州市中医医院骨科（广东惠州 516000）

3.暨南大学中医学院（广州 510000）

骨质疏松症（osteoporosis,OP）严重影响患者的健康水平，该病是一种全身性骨病，以骨量低下、骨微结构损坏、骨脆性增加为主要病理变化。OP主要致病因素包括成骨潜能减弱和破骨潜能增强，原发性骨重塑失衡最终导致骨破坏[1]。目前，针对OP防治的研究更倾向于阻止骨髓基质干细胞向脂肪细胞分化，增强其向成骨细胞分化的能力[2]。因此，脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs）成骨分化是治疗OP的潜在策略。中医将OP归属于“骨痿”范畴，其主要病机是肾虚精亏，辨证论治以补肾为主。淫羊藿具有补肾阳、强筋骨之功，含有多种化学成分及微量元素，如淫羊藿苷、淫羊藿素、淫羊藿多糖等，具有抗炎、抗氧化、抗骨质疏松、抗肿瘤、抗抑郁等作用，临床应用广泛[3-4]。前期研究证实，中药淫羊藿可促进骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）、ADSCs的成骨分化[5]，其作用机制可能与过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ）、Ajuba、Hippo信号通路相关。现就淫羊藿防治OP与Ajuba/Hippo/PPARγ信号轴的相关性，以及可能存在的作用机制作如下综述，旨在初步阐明淫羊藿防治OP相关分子的作用机制。

1 淫羊藿治疗骨质疏松症的概述

1.1 中医关于骨质疏松症的概述

中医学中无“OP”这一病名，历代中医文献记载中的“骨痿”“骨枯”等证的描述与现代医学OP的临床表现及发病机制颇为相似。《素问·痿论》曰：“肾主身之骨髓，肾气热，则腰脊不举，肾枯而髓减，发为骨痿”。肾藏精，主骨生髓，精化髓，骨赖髓以充养，肾精充足则髓充而骨坚韧；肾精不足，骨髓空虚，骨失其养而脆弱无力，不耐久立和劳作。目前中医将其归属于骨痿范畴，其主要病机是肾虚精亏，辨证论治以补肾为主。

1.2 淫羊藿概述

淫羊藿性味辛甘性温，归肝、肾经；功善补肾阳、强筋骨、祛风湿，用于肾阳虚衰、阳痿遗精、筋骨痿软、风湿痹痛、麻木拘挛等症。该药功效古籍中亦有记载，《本草纲目》中称其有“益精气，坚筋骨，补腰膝，强心力”之功效；《日华子本草》载“治一切冷风劳气，补腰膝，强心力，丈夫绝阳不起，女子绝阴无子，筋骨挛急，四肢不任，老人昏耄，中年健忘”。淫羊藿作为防治OP最常用的中药之一，其安全性和有效性已被证实[6-7]。研究表明，淫羊藿具有抗OP、调节免疫、抗氧化、延缓衰老、抗肿瘤等作用，淫羊藿植物、酮类物质及活性单体多次被证明具有类雌激素样作用[8-9]。淫羊藿还参与调节大量与细胞因子、肿瘤、免疫、自噬、凋亡、神经传导、雌激素相关信号通路及生物过程[10-11]。

1.3 淫羊藿促进骨细胞成骨分化

淫羊藿有效成分淫羊藿苷可促进成骨细胞增殖与分化、矿化结节形成与骨形成。同时，还能降低破骨细胞中钙离子浓度，减少细胞内超氧阴离子自由基，导致吸收陷窝面积减小，抑制破骨细胞的骨吸收。淫羊藿苷作用机制包括：抑制膜铁转运蛋白1（ferroportin 1,FPN1）表达，调节铁死亡通路，促进成骨细胞增殖及分化[12]；保护高糖诱导的成骨细胞，促进其增殖，作用机制可能与调控成骨细胞ISR1/AKT/Runx2信号通路有关[13]；促进负调控因子Gα13的表达，从而抑制其下游Akt-GSK3β-NFATc1信号通路以抑制破骨细胞形成[14]；上调Nrf2/HO-1信号传导通路，促进破骨细胞氧化应激改变，增加破骨细胞内ROS水平，提高破骨细胞内亚铁离子水平，下调铁代谢相关的GPX4基因表达，进而调控破骨细胞内铁代谢水平，增加其氧化应激损伤，从而抑制破骨细胞形成和骨吸收[15]；增加去卵巢骨质疏松大鼠骨密度和骨矿含量，改善血清BGP、ALP、Ca水平，抑制成骨细胞凋亡；其机制可能与上调骨组织OPG mRNA表达、下调RANKL mRNA、RANK mRNA表达有关[16]。

1.4 淫羊藿促进脂肪间充质干细胞成骨分化

淫羊藿苷可直接抑制破骨细胞，促进成骨细胞增殖，改善骨组织微结构。多项研究表明，浓度为10-7mol/L的淫羊藿苷具有促进雄性小鼠ADSCs成骨分化的作用[17-18]。此外，淫羊藿可促进BMSCs成骨分化，抑制其向脂肪分化[19-20]。相较于BMSCs，ADSCs在来源、取材方法以及成果分化和繁殖速度等方面有更多优势[21-22]。因此，淫羊藿调控ADSCs成骨分化的研究和应用价值更大。

研究发现，淫羊藿可促进ADSCs成骨分化，抑制成脂分化[5]。进一步通过RNA测序分析筛选出Ajuba基因，发现其在淫羊藿组诱导后表达明显降低。同时结合基因集富集分析发现Ajuba与干细胞相关，结合测序结果中差异基因的通路分析，结果发现调节Hippo信号通路的差异基因占有较大比例；同时通过荧光素酶活性检测发现，Ajuba高表达，Hippo信号通路活性受到抑制。

2 脂肪间充质干细胞对骨细胞的成骨分化作用

目前公认的OP发病机制是成骨细胞和破骨细胞在塑造过程中失衡，成骨细胞数量和活性降低，破骨细胞数量及活性增加，导致骨吸收大于骨形成，造成骨质疏松。此前研究多集中在BMSCs成骨分化方面，但是BMSCs体外培养对取材要求高，需从骨髓腔中取材，取材困难，且其来源少，更重要的是细胞增殖速度较慢，限制了其广泛应用。ADSCs是从脂肪组织中分离得到的一种多向分化的干细胞，可分泌包括血管内皮细胞生长因子、脑源性神经营养因子及肝细胞生长因子等多种细胞因子[23]。ADSCs具有体内储存量大、可反复取材、容易获取及增殖能力较强的特点，且具有免疫原性较低、成瘤性较低、移植排斥反应较少的特点，是理想的种子细胞来源[2,24]。既往研究证实，应用SDF-1、NELL-1单独转染，或两者共转染ADSCs，特别是两种基因共同转染，可显著增强ADSCs的体外成骨效果[25]；合适的应力刺激可以提高ADSCs内成骨相关mRNA表达，并促进其向成骨细胞分化[26-27]。卓丽丹等研究证实，BMSCs和ADSCs生物学性状稳定，均具有成骨分化潜能；细胞增殖实验显示P3代ADSCs的增殖能力强于BMSCs[28]。上述研究表明ADSCs在受到物理、化学等刺激时可通过不同机制加强ADSCs成骨分化倾向。

3 Ajuba蛋白调控Hippo通路参与脂肪间充质干细胞成骨分化

3.1 PPARγ与骨质疏松症发病机制、干细胞成脂分化关系

PPARγ主要在脂肪组织中表达，调控脂肪细胞的分化，其中PPARγ2较特异地在脂肪组织中表达，被诱导后启动脂肪细胞基因转录，是促进脂肪细胞分化最关键的调控因子。研究发现活化PPARγ可促进ADSCs向脂肪细胞分化，抑制成骨分化[29]。Sirtuin 蛋白家族是一类高度保守的、NAD+依赖的蛋白去乙酰化酶和 ADP 核糖基转移酶，在卡路里限制、细胞寿命调控和多种糖脂代谢中起重要作用。其中Sirt1为Sirtuin 蛋白家族重要成员之一，调控多种细胞转录因子，具有平衡干细胞的静息与增殖、维持干细胞自我更新功能、缓解年龄相关性成体干细胞功能下降和抑制成体干细胞分化紊乱的作用。研究发现Sirt1是PPARγ2的上游调控因子，可使PPARγ2乙酰化，从而抑制其活性[30]。应用淫羊藿含药血清干预去势大鼠BMSCs，能够有效上调Sirt1表达水平，抑制PPARγ表达，促进BMSCs成骨分化、抑制其成脂分化的作用，从而发挥淫羊藿对OP的防治作用[31-32]。

3.2 Hippo通路与骨质疏松症发病机制

进化上高度保守的Hippo信号通路是细胞正常生命活动的重要调节器，其在调控器官发育、肿瘤发生发展和组织稳态方面具有重要作用。近年来，Hippo信号通路调节骨代谢的潜在生物学机制成为该领域又一研究热点。哺乳动物Yes相关蛋白（yes-associated protein,YAP）/携带PDZ结合基序的转录辅助激活物（transcriptional coactivator,TAZ）为Hippo信号通路核心组件，在其上下游多种转录因子的介导下，Hippo信号通路调控成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞等细胞的生理活动。研究发现，Hippo途径通过激酶级联控制YAP/TAZ转录辅活化因子的活性，这一途径在细胞分化和组织生长中起着关键作用[33]。YAP和TAZ是两种促进细胞增殖、干细胞维持和组织稳态的同源转录辅激活因子。Hippo通路参与成骨分化，TAZ能与Runx2结合入核，促进成骨相关基因表达，从而促进成骨分化[34]。胡佳安等研究发现，ADSCs体外成骨分化过程中TAZ表达上调，而在成脂分化中其表达降低[35]；TAZ激动剂TM-25659可以促进ADSCs中TAZ的表达，并增强ADSCs体内成骨及骨生成能力；当TAZ通过WW结构域与PPARγ的PPXY模体结合后，抑制PPARγ活性，进而抑制ADSCs向脂肪细胞分化，促进其向成骨细胞分化[36]。同时，YAP也有类似的作用。磷酸化的YAP可在细胞核内与Runx2结合，促进BMSCs成骨分化，抑制其成脂分化，且其成骨分化程度与细胞骨架密度呈正相关[37]。

3.3 Ajuba与PPARγ、Hippo信号通路相关性

Ajuba分子属于Zyxin/Ajuba家族，作为支架蛋白或衔接蛋白参与细胞黏附、增殖、迁移等功能，其在调节器官发育过程中的细胞增殖反应、修复受损组织和早期癌症发展中发挥关键作用，并在细胞增殖过程中限制Hippo信号通路活性[38]。YAP1是Hippo信号通路下游的主要效应因子。在哺乳动物和果蝇细胞中，Ajuba可以通过抑制细胞内的Hippo激酶复合物，使YAP1去磷酸化，抑制Hippo信号通路，从而促进细胞增殖[39]。Ajuba是细胞成脂分化的重要调节剂，是一种新型的PPARγ相互作用蛋白。Ajuba与LPL启动子的结合在很大程度上取决于PPARγ的存在，进而可以增强Ajuba和PPARγ的DNA结合，Ajuba通过其preLIM区域直接结合PPARγ的DNA结合结构域，需要Ajuba才能最大程度地激活PPARγ，Ajuba和PPARγ协同作用激活靶基因的表达。此外，Ajuba通过与C/EBPβ的相互作用促进C/EBPβ与PPARγ和C/EBPα启动子结合促进脂肪生成[40]。Ajuba可以免疫沉淀内源性p300和CBP，是PPARγ有效募集p300/CBP所必需的目标染色质，可通过其LIM域将p300/CBP募集到PPARγ，表明PPARγ与Ajuba成员选择性相互作用[41]。

根据上述研究可以初步推断，在OP发病机制中，PPARγ、Hippo通路、Ajuba三者之间存在着密切的关联性；结合前期实验研究，中药淫羊藿作用于ADSCs防治OP的作用机制，可能与其通过Ajuba/Hippo/PPARγ通路诱导ADSCs成骨分化有关。

4 结语

间充质干细胞成骨分化减少、成脂分化增加导致的骨平衡失稳是OP发生的重要因素之一，通过促进ADSCs成骨分化、增加骨形成可以作为OP的潜在治疗方案[42-43]。此外，还有研究表明通过移植ADSCs可以改善去势大鼠的骨量流失[44]；通过淫羊藿苷干预可以提高复合支架共培养ADSCs的存活率并促进其成骨分化[45]。然而，ADSCs具有多种分化潜能，其中的调控机制尚不十分明确。结合前期工作及目前研究情况，故推测淫羊藿诱导ADSCs成骨分化，抑制其成脂分化，可能通过调控Ajuba/Hippo/PPARγ信号轴发挥相关作用。Ajuba/Hippo/PPARγ信号轴在淫羊藿刺激诱导ADSCs成骨及成脂的分化过程中起着重要的作用，探明其作用相关分子机制将为淫羊藿干预ADSCs的临床干细胞治疗提供实验数据，明确淫羊藿促进ADSCs成骨分化的分子机制，为淫羊藿防治OP的临床应用提供实验依据。同时，临床应用ADSCs治疗OP仍存在许多问题，如治疗途径、移植治疗后细胞迁移及归巢等。下一步研究中，将致力于药物干预后干细胞临床治疗的相关研究，以获得更为有效的OP诊疗方法。