徐 微,徐建光,何雪云,林小花

徐微,徐建光,何雪云,林小花,衢州市人民医院(衢州四省边际中心医院)消化内科 浙江省衢州市 324000

0 引言

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)为一种微需氧、螺旋状革兰阴性菌,多定植于机体胃肠道内,Warren与Marshall在1983年首次从胃内分离中.流行病学研究表明H.pylori感染了世界范围内一半以上的人口.目前已知发病率的高低与社会经济水平,人口密集程度,公共卫生条件以及水源供应有较密切的关系.中国及大多数发展中国家人群H.pylori感染因地区有所不同.低达20%,高达90%,人群中总感染率高于发达国家.临床研究已经明确,H.pylori的长期慢性感染为人们发生胃癌、消化性溃疡、慢性活动性胃炎及黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等疾病主要因素[1,2].当前,临床对预防H.pylori相关胃十二指肠疾病主要疗法为根除H.pylori,西医的三联治疗,如BAM、OAC等一度使临床患者H.pylori根除率达90%以上[3],但近些年来,由于患者对西药耐药率的升高、治疗依从性差及药物不良反应等,使H.pylori根除率明显降低,因此,临床急需一些新的治疗方案.当前,随着中医学在临床的广泛应用,中药有对患者耐药性低、不良发应小及不引起肠道菌群失调等特点,这说明在对H.pylori感染的治疗方案中医药有一定优势[4].芍药苷(paeoniflorin,PF)为单萜类糖苷化合物,是传统中药芍药主要成分,有免疫调节、抗炎、抗血小板聚集及抗氧化等影响[5].有研究显示,PF可经过对TLR2信号路径抑制来降低巨噬细胞活化[6].因此,本研究经过分析PF通过调控巨噬细胞活性抗H.pylori作用及相关机制,为临床患者诊疗提供一些借鉴.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物: 昆明小鼠6只,雌雄各半,体重22 g-26 g;新西兰家兔4只,雌雄各半,体重2.0 kg-2.6 kg,均购自上海斯莱克实验动物公司.常规饲养3 d后开始实验,室温维持22 ℃-26 ℃,相对湿度55%-65%,昼夜循环,保持12 h光照,小鼠灌胃、添加饲料及换水等均有专人进行.

1.1.2 实验药物、试剂: 芍药苷(南京广润生物公司),兔抗TLR2多克隆抗体(美国EMD Millipore公司),兔抗诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、Toll样受体4(toll-like receptor-4,TLR4)多克隆抗体(美国Abcam公司),人单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)试剂盒(北京瑞博奥生物公司),白细胞介素(interleukin,IL)-1β、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)(美国RD Systems公司).

1.2 方法 (1)确定实验剂量.急毒实验14 d,设置药物梯度浓度,分别为(10,30,50,70,90) mg/kg,确定安全的给药剂量EC50,以EC50进行动物实验;(2)制备含药血清,家兔实验前禁食12 h,依据人和动物剂量转换,药物组灌胃家兔26 mg/kg的PF药液,对照组家兔灌胃等剂量生理盐水,共灌胃3次,首次和第二次灌药间隔20 h,第二次和第三次灌药间隔4 h.末次给药后2 h在无菌条件下心脏采血,室温下静置3 h,离心机3000 rmp离心15 min,血清分离,在同种条件下将药物血清摇匀,于56 ℃下水浴灭活20 min,保存备用;(3)提取小鼠腹腔巨噬细胞,无菌淀粉肉汤2 mL注入至小鼠腹腔内,1次/d,共注射3 d.末次注射后小鼠脱颈椎处死,在75%乙醇内浸泡5 min.小鼠取出后酒精沥干,在无菌纱布上仰卧放置.在下腹皮肤处剪一小口,在将全部腹部皮肤剪开,暴露腹壁.采用针管吸出3 mL至4 mL的腹腔液,离心机离心后上清去除.DMEM高糖培养基(含10%胎牛血清、1%双抗)培养,放置与37 ℃、50 mL/L CO2、饱和湿度二氧化碳培养箱内;(4)含药血清作用于小鼠腹腔巨噬细胞,实验组加入5%含药血清,对照组加入无药血清,各组同时在加入H.pylori11637,每组小鼠腹腔内巨噬细胞达到4×106.含药血清在作用6 h后收集细胞.未经H.pylori11637作用的巨噬细胞作为空白组.

1.3 观察指标 (1)采集样品,小鼠所分离腹腔巨噬细胞注入培养皿内,在加入培养基(含10%胎牛血清)培养.在细胞贴壁后将上清和细胞碎片吸走,实验组在加入含药血清、培养基(含10%胎牛血清)与H.pylori11637培养上清,含药血清作用6 h后采用2×106个细胞用于各项检测;(2)采集巨噬细胞培养的上清液,ELISA法检测各组小鼠MCP-1、IL-1β、TNF-α含量,具体步骤依据试剂盒说明书进行;(3)Western-Blot检测热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)、iNOS、Toll样受体2(toll-like receptor-2,TLR2)及TLR4蛋白表达,细胞研磨,经组织裂解上样电泳,起始电压80 V,溴酚蓝染料前缘进入分离胶上缘后电压提升至100 V,溴酚蓝泳出分离胶下缘电泳结束.半干电转移仪于PVDF膜内行蛋白质电转移,恒流30 mA,连续90 min.PVDF膜取出5%TBST脱脂奶粉封闭,震荡60 min.结束封闭TNS-T漂洗液洗膜10 min,3次,膜转转移至杂交袋,加入适量漂洗液稀释抗体,封口后4 ℃下孵育过夜;TBST漂洗液洗膜10 min,3次,加入漂洗液稀释辣根过氧化物酶标记二抗,震荡60 min.PVDF膜放置在ECL显色液内震荡温育5 min,暗室下曝光、显影及定影.清水冲洗以后,晾干扫描,IPP软件对扫描图像目的条带行灰度分析;(4)检测小鼠细胞HSP70 mRNA、TLR2 mRNA及TLR4 mRNA表达,Trizol法提取小鼠细胞总RNA行RT-PCR扩增,HSP70上游引物5’-GATTGAGATGATTTTGGAG-3’,下游引物5’-GTATGTTAAGTATATGATTG-3’,扩增片段是482 bp;TLR2上游引物5’-GCTCCAGGAATTCCTCGGTA-3’,下游引物5’-GAGTCCTGCATGCTAGCTAG-3’,扩增片段为389 bp;TLR4上游引物5’-GAATTGCGCGATGTAGTACG-3’,下游引物5’-GTTGTACTGTACTAGGTGCT-3’,扩增片段531 bp;内参β-actin上游引物5’-CTTGATCGTACGTAGCCTGA-3’,下游引物5’-GTGTAGTGTACTGTCATGCA-3’,扩增片段482 bp.PCR反应条件: 94 ℃下45 s,55 ℃下50 s,72 ℃下75 s,在40次循环以后获取核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB) mRNA、MyD88 mRNA及TLR4 mRNA循环阈值(Ct),使用△△Ct(△△Ct=Ct目的基因-△Ct内参基因)分析,算出2-△△Ct目的基因相对表达量.

统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析,计量资料(mean±SD)表示,t检验,计数资料采用n(%)表示,χ2检验,多组间比较用单因素方差分析,两两比较用LSD-t检验,P＜0.05差异有统计学意义.

2 结果

2.1 PF的有效浓度的确定 通过有效浓度曲线得出,PF对于家兔的EC50为45 mg/mL.

2.2 各组小鼠巨噬细胞上清液内MCP-1、IL-1β及TNF-α含量 对照组小鼠MCP-1、IL-1β及TNF-α含量较空白组升高,实验组小鼠MCP-1、IL-1β及TNF-α含量较对照组降低,差异均有统计学意义(P＜0.05),详见表1.

表1 各组小鼠巨噬细胞上清液内MCP-1、IL-1β及TNF-α含量(n=2×106,mean±SD)

2.3 各组小鼠巨噬细胞iNOS、TLR4及TLR2蛋白表达对照组巨噬细胞iNOS、TLR4及TLR2蛋白表达较空白组升高;实验组巨噬细胞iNOS、TLR4及TLR2蛋白表达较对照组降低,差异有统计学意义(P＜0.05),详见表2,图1.

表2 各组小鼠巨噬细胞iNOS、TLR4及TLR2蛋白表达对比(n=2×106,mean±SD)

图1 各组巨噬细胞iNOS、TLR4及TLR2蛋白表达.iNOS: 诱导型一氧化氮合酶;TLR4: Toll样受体4;TLR2: Toll样受体2;β-actin: β-肌动蛋白.

2.4 各组小鼠巨噬细胞TLR4、TLR2 mRNA相对表达量 对照组小鼠巨噬细胞TLR4、TLR2 mRNA相对表达量较空白组升高,实验组小鼠巨噬细胞TLR4、TLR2 mRNA相对表达量较对照组降低,差异有统计学意义(P＜0.05),详见表3.

表3 各组小鼠巨噬细胞TLR4、TLR2 mRNA相对表达量(n=2×106,mean±SD)

2.5 各组小鼠巨噬细胞HSP70 mRNA及蛋白表达 对照组小鼠巨噬细胞HSP70 mRNA及蛋白表达较空白组升高,实验组小鼠巨噬细胞HSP70 mRNA及蛋白表达较对照组降低,差异有统计学意义(P＜0.05),详见表4,图2.

表4 各组小鼠巨噬细胞HSP70 mRNA及蛋白表达(n=2×106,mean±SD)

图2 各组小鼠巨噬细胞HSP70蛋白表达.HSP70: 热休克蛋白70;β-actin: β-肌动蛋白.

3 讨论

机体感染H.pylori后,抵抗H.pylori感染天然屏障为机体内固有免疫,胃组织内树突状细胞、巨噬细胞等固有免疫细胞经过分泌IL-18等细胞因子,将免疫细胞激活并分泌炎症介质,从而起到抗感染的作用[7,8].H.pylori感染胃组织内巨噬细胞后,炎症组织局部巨噬细胞经浸润、增生、激活同时分泌TNF-α等细胞因子,将入侵微生物杀伤并将淋巴细胞活化.同时TNF-α协同诱导巨噬细胞形成NO,导致DNA受损引起宿主细胞凋亡[9-11].

长期以来西药治疗H.pylori感染取得了较好疗效,但对于H.pylori清除仍有一定困难,患者在停药后易复发.目前,在临床上H.pylori对于抗生素,尤其是甲硝唑、克拉霉素等原发耐药率普遍升高,这了严重影响了常用根治方案的治疗效果.PF有多重生物学功效,包含抗风湿、神经保护、诱导肿瘤细胞凋亡、加速肝细胞再生等,由于其毒副影响较小而在临床广泛使用.近些年来,相关研究显示PF还可下调IL-6、IL-1β、TNF-α等细胞因子活性,发挥广泛抗炎影响[12].本文研究显示,实验组小鼠MCP-1、IL-1β及TNF-α含量较对照组降低,差异均有统计学意义,和上述研究结果一致.

TLR4与TLR2为Toll样受体,为Ⅰ型跨膜受体蛋白,多在抗原提呈细胞内表达,激活以后可将MyD88通路启动,对IRAKs家族招募并结合TRAF6,将NF-κB活化[13].NF-κB是Rel家族转录因子,一般指p65和p50所构成异源二聚体,在静息时结合抑制蛋白IkB存在细胞质内,在外界刺激后和IkB解离并进入到细胞核中,进而释放MCP-1、TNF-α及IL-1β等促炎细胞因子.另外,TLR4还能够经过TRIF路径将IRF3激活,行信号转导将炎症反应启动[14].本文研究显示,实验组巨噬细胞LR4、TLR2 mRNA及蛋白表达较对照组降低,差异有统计学意义,说明PF对H.pylori感染的治疗,有巨噬细胞的参与,且这一抗炎作用可能和TLR2/4通路有关.

HSP70为热休克蛋白家族内主要成员之一,其分子量约为70 kD.正常细胞内HSP70水平比较低,但在应激情况其含量会显著提升.对于机体胃肠道来讲,H.pylori感染为长期慢性应激,一般会造成胃黏膜内HSP70高表达.通常HSP70多位于胞浆中,若受到热休克刺激细胞核内HSP70含量会快速升高,仅有少量存在于胞浆内,细胞在恢复阶段时细胞核中HSP70则会消失,而胞浆内依然有低水平的HSP70表达,对细胞内HSP70细胞检测可反映其胃炎进展情况[15].实验组小鼠巨噬细胞HSP70 mRNA及蛋白表达较对照组降低,差异有统计学意义,说明PF可调控巨噬细胞分泌HSP70,降低H.pylori对胃黏膜刺激作用.

4 结论

综上所述,芍药苷经过调节巨噬细胞活性起到抗H.pylori感染作用,可抑制巨噬细胞分泌炎症因子与HSP70应激因子,其抗炎作用可能和抑制巨噬细胞TLR2/4信号通路有关.

文章亮点

实验背景

中国有的地区感染幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)的人群高达90%,容易引起胃癌、消化性溃疡、慢性活动性胃炎及黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等胃部疾病.西药治疗效果显著,但是易反复,且长期服用副作用明显.

实验动机

目前,H.pylori感染治疗药物主要是四联疗法.相当一部分人并不适合其中的抗生素治疗,因此疗效欠佳.芍药苷治疗H.pylori,作为中成药,不仅副作用下,而且适用于更广泛的人群.

实验目标

芍药苷的重要特性在治疗H.pylori中发挥了不错的疗效,但是具体发挥作用的机制并不清楚,本研究从巨噬细胞的调控入手,分析芍药苷抗H.pylori的作用及相关机制.

实验方法

通过小鼠动物模型,采用Western Blot和荧光定量PCR的方法对巨噬细胞相关的免疫指标进行检测,观察H.pylori的数量,分析相关信号通路的相互影响,判断芍药苷对H.pylori的影响.

实验结果

与对照组相比,经过芍药苷处理的小鼠的单核细胞趋化蛋白1、白介素1β、肿瘤坏死因子含量、巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶、Toll样受体4(toll-like receptor-4,TLR4)、Toll样受体2(toll-like receptor-2,TLR2)、热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)mRNA及蛋白表达均较低.

实验结论

芍药苷通过调节巨噬细胞分泌炎症因子、HSP70应激因子以及TLR2/4信号通路,调节巨噬细胞活性,对H.pylori的感染起到积极的治疗作用.

展望前景

本研究从巨噬细胞中发现了芍药苷对H.pylori杀灭的机理,但是是否还有其他相关作用机制还需进一步研究.