李 丽,冯 旭,贺付蒙,冯珊珊,李凤兰,胡宝忠,2,徐永清

(1.东北农业大学生命科学学院, 黑龙江哈尔滨 150030; 2.哈尔滨学院,黑龙江哈尔滨 150086)

扩展蛋白(expansin)是一类具有非水解活性的细胞壁松弛蛋白,于1992年由Mcqueen等在黄瓜(Cucumissativus)的下胚轴中首次被发现[1-2]。植物扩展蛋白可分为EXPA、EXPB、EXLA和EXLB四个亚家族,由信号肽、结合区和催化区组成[3]。研究表明,扩展蛋白不仅参与植物的发育进程(细胞生长、组织分化、根毛发生、花粉管伸长、果实软化等[4-6]),而且也参与植物对干旱、低温等逆境胁迫响应过程,如低温胁迫下,西葫芦(Cucurbita pepo)和矮牵牛(Petunia hybrida)中扩展蛋白基因的表达量显著增加[7-8];大麦(Hordeum vulgare)中扩展蛋白基因HvEXPB7受干旱胁迫诱导表达,以促进根毛生长的作用方式提高植株的干旱胁迫耐受性[9];白菜(Brassica rapa)扩展蛋白基因BrEXLB1的过表达植株中,该基因的表达与营养生长期的耐旱性和光合作用呈正相关[10]。此外,扩展蛋白在植物应对盐、重金属等胁迫过程中也发挥着重要功能[11]。

低温胁迫是影响农作物生产的主要非生物胁迫之一,严重威胁农业生产和粮食安全[12-13]。高抗寒冬小麦品种东农冬麦2号在极寒条件下可以安全越冬,具有宝贵的抗性基因资源[14]。本课题组前期研究结果表明,东农冬麦2号分蘖节中TaEXPB7-B基因的表达受低温和脱落酸处理诱导,且过表达TaEXPB7-B、TaEXPA8-B/D、TaEXPA7-A/B/D基因均可显著促进拟南芥的生长以及对低温胁迫的耐受性[15-17]。冯珊珊等[18]从东农冬麦2号中克隆了TaEXPA12-A/B/D基因,这3个基因在干旱、脱落酸、茉莉酸甲酯及水杨酸等处理下均上调表达,说明其可能参与冬小麦对非生物胁迫的响应。

为进一步鉴定TaEXPB12-A/B/D基因的功能,以东农冬麦2号为试验材料,通过农杆菌介导的遗传转化体系,将TaEXPB12-A/B/D三个基因分别转入模式植物拟南芥中,同时探讨了TaEXPB12-A/B/D基因对于植物生长和低温耐受性的影响,以期为冬小麦扩展蛋白的相关研究提供新的理论基础,同时为寒地作物分子育种提供优质的基因资源。

1 材料与方法

1.1 植物材料

试验所用小麦材料为高抗寒冬小麦品种东农冬麦2号,拟南芥材料为Colombia野生型,均由东北农业大学植物资源与分子生物学实验室提供。

1.2 载体及菌株

植物双元表达载体pBI121(CaMV 35S启动子驱动,含有Kan抗性)由东北农业大学植物资源与分子生物学实验室提供。大肠杆菌(Escherichiacoli)感受态Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell购于北京全式金生物有限公司,根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)感受态GV3101购于上海唯地生物有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 含HA标签重组PBI121-TaEXPB12-A/B/D表达载体的构建

参考冯珊珊等[18]的方法进行TaEXPB12-A/B/D基因的克隆,通过PCR分别在TaEXPB12-A/B/D三个基因的上游添加XbaI酶切位点和HA标签序列,下游添加BamHI酶切位点,所用PCR引物见表1。利用限制性内切酶XbaI和BamHI对上述PCR产物和pBI121载体进行双酶切,酶切产物经纯化后用T4连接酶连接,并转化至大肠杆菌中,然后送哈尔滨擎科生物公司进行测序。

1.3.2 表达载体转化农杆菌

分别将含HA标签的pBI121-TaEXPA12-A/B/D三个表达载体转化至根癌农杆菌感受态细胞GV3101中,对阳性菌落进行PCR鉴定,所用PCR引物见表1。

1.3.3 拟南芥的遗传转化

通过农杆菌介导的方法转化拟南芥,具体参考Feng等[15]的方法进行。利用PCR及Western-blot方法分别对阳性转基因拟南芥植株进行鉴定,试验所用PCR引物见表1,Western-blot试验所用抗体为Anti-HA,蛋白质提取、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳所用试剂盒均购于北京索莱宝科技有限公司,方法详见说明书。

1.3.4 转基因拟南芥的形态学观察

分别将野生型和T3代转基因拟南芥的种子播种于装有1/2 MS培养基(含50 mg·L-1Kan)的平皿上,在无菌室培养(16 h/8 h光周期,25 ℃/20 ℃昼夜温度)7 d后,观察植株根系的生长情况;待拟南芥生长至4叶期时,移栽至营养钵中(营养土∶蛭石=3∶1),培养条件同上,14 d后观察叶片的生长情况,21 d后观察并测定株高。将拟南芥种子播种于装有1/2 MS培养基(含50 mg·L-1Kan)的垂直板上,10 d后观察侧根的生长情况。

1.3.5 低温胁迫下转基因拟南芥的表型观察及生理指标测定

取在营养体中生长至40 d且长势一致的拟南芥植株,一部分置于-20℃的环境中,冷驯化30 min后取出,于正常条件下培养7 d后统计存活率;一部分置于4℃培养箱中模拟低温胁迫处理,分别于处理后0、3、6、12、24和48 h对全株进行取样,进行生理指标的测定,其中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)的活性及丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)、可溶性糖含量的测定均参照苏州科铭生物技术有限公司所购试剂盒的说明书进行。

1.4 数据统计

所有试验均至少重复3次(n≥10),数据显示为平均值±标准差,用GraphPad Prism 7 进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 含HA标签重组pBI121-TaEXPA12-A/B/D表达载体的构建

分别在TaEXPB12-A/B/D三个基因的上游添加XbaI酶切位点和HA标签序列,下游添加BamHI酶切位点,PCR结果如图1所示。对pBI121表达载体和上述PCR产物进行双酶切并连接,连接产物转化至大肠杆菌后,挑取菌落进行PCR鉴定,阳性菌落的PCR检测结果如图2所示。将测序结果正确的pBI121-TaEXPA12-A/B/D载体分别转化至根癌农杆菌感受态细胞GV3101中,阳性菌落的PCR鉴定结果如图3所示,条带大小与图1和图2一致,表明已成功获得含有pBI121-TaEXPA12-A/B/D载体的根癌农杆菌。

M: DL2000; 1: TaEXPB12-A; 2: TaEXPB12-B; 3: TaEXPB12-D.图1 TaEXPB12-A/B/D基因添加酶切位点的PCR结果Fig. 1 PCR results of TaEXPB12-A/B/D genes with the added restriction enzyme sites

M: DL2000; 1: pBI121-TaEXPB12-A; 2: pBI121-TaEXPB12-B; 3: pBI121-TaEXPB12-D.图2 pBI121-TaEXPB12-A/B/D重组载体的菌落PCR结果Fig. 2 Colony PCR results of pBI121-TaEXPA12-A/B/D recombinant vectors

M: DL2000; A1 and A2: pBI121-TaEXPB12-A; B1 and B2: pBI121-TaEXPB12-B; D1 and D2: pBI121-TaEXPB12-D.图3 含有pBI121-TaEXPB12-A/B/D载体农杆菌的PCR鉴定结果Fig. 3 PCR identification results of Agrobacterium containing pBI121-TaEXPB12-A/B/D vectors

2.2 转TaEXPB12-A/B/D基因拟南芥植株的筛选与鉴定

将野生型和转基因植株T0代的种子播种在含有50 mg·L-1Kan的1/2 MS培养基中进行筛选,结果如图4A所示。将阳性植株(T1代)移至营养钵中培养,以此模式筛选至T3代植株。对T3代植株分别进行PCR和Western-blot,结果(图4B和4C)表明,TaEXPB12-A/B/D基因已成功转化至拟南芥的基因组中,且其编码的蛋白已表达。

2.3 T3代转TaEXPB12-A/B/D基因拟南芥的形态学分析

对在1/2 MS培养基上生长7 d的拟南芥植株进行根部观察,并测定其根长,结果(图5A,5B)显示,TaEXPB12-A/B/D三个基因的过表达显著促进了拟南芥根的伸长和根毛的生长。对在垂直平板上生长10 d的拟南芥植株进行侧根观察,结果(图5C)显示,转TaEXPB12-A/B/D基因拟南芥的平均侧根数目分别为39、40和39,约为野生型的2倍。对转TaEXPB12-A/B/D基因拟南芥的叶片及株高进行观察并测定,结果(表2)显示,转基因拟南芥的叶片数目约为野生型的1.6倍,叶宽约为野生型的1.7倍,差异均达显著水平,但转基因拟南芥的株高与野生型无显著差异。

A:根长;B:根毛形态;C:侧根数目。A: Root length; B: Root hair morphology; C: Lateral root number.图5 野生型和转基因拟南芥的根长、根毛形态和侧根数目比较Fig. 5 Comparisons of root length, root hair morphology and lateral roots number between wild-type and transgenic Arabidopsis

表2 野生型和转基因拟南芥的叶片数目、叶宽和株高比较Table 2 Comparisons of leaf number, leaf width, and plant height between wild type and transgenic Arabidopsis

2.4 低温胁迫对转TaEXPB12-A/B/D基因拟南芥植株的影响

将野生型和转TaEXPB12-A/B/D基因拟南芥置于-20℃的环境中冷驯化30 min后,发现野生型和转基因拟南芥均受到了不同程度的伤害,表现为植株叶片萎蔫、颜色加深,但转基因拟南芥受到的伤害略小于野生型。继续在正常条件下培养7 d后,野生型和转基因拟南芥均恢复正常生长,转基因TaEXPB12-A/B/D拟南芥的存活率分别为79%、75%和71%,约为野生型的1.8倍(图6)。这说明TaEXPB12-A/B/D基因的过表达提高了拟南芥的抗寒能力。

A:表型;B:存活率,**表示转基因植株与野生型的存活率在0.01水平上差异显著。A: Phenotype; B: Survival rate, ** indicates significant difference of survival rate between wild type and transgenic plants at 0.01 level.图6 -20 ℃处理下野生型和转基因拟南芥的表型和存活率比较Fig. 6 Comparisons of phenotype and survival rate between wild type and transgenic Arabidopsis under -20 ℃ treatment

同时,对野生型和转TaEXPB12-A/B/D基因拟南芥在4 ℃低温胁迫下的生理指标进行测定,结果(表3)显示,在4℃处理各时间点,转基因拟南芥的抗氧化物酶(SOD、POD、CAT)活性均高于野生型,而MDA含量相对较低。其中,转TaEXPB12-A/B/D基因拟南芥的SOD活性在4℃处理0～48 h均显著高于野生型;POD活性在4℃处理6～24 h均显著高于野生型;CAT活性在4℃处理3～48 h均显著高于野生型;MDA含量在4℃处理3 h均显著低于野生型。植株中Pro和可溶性糖含量测定结果显示,在4℃处理各时间点,转基因拟南芥的Pro含量均高于野生型,其中在4 ℃处理0、3、12和48 h差异达显著水平;除4 ℃处理0和6 h外的其他时间点,转基因拟南芥的可溶性糖含量均显著高于野生型。

表3 4℃处理下野生型和转基因拟南芥中的生理指标Table 3 Physiological indices in wild type and transgenic Arabidopsis under 4 ℃ treatment

3 讨论

研究发现,在拟南芥中过表达水稻扩展蛋白基因OsEXPA17和小麦扩展蛋白基因TaEXPB1A,均能显著促进拟南芥根系网络的建成,并提高生物量,进而促进植株生长[19-20]。本研究发现,转基因拟南芥的根长和侧根数目均明显高于野生型,说明TaEXPB12-A/B/D基因显著促进了转基因拟南芥根的生长,有利于植株在干旱胁迫条件下更有效地吸收土壤中的水分和养分。Cho等[21]研究表明,在拟南芥中过表达扩展蛋白基因AtEXP10增加了植株的叶面积,相反,抑制其表达则导致叶面积减小。本研究发现,TaEXPB12-A/B/D基因能显著增加拟南芥的叶宽,有助于提高叶面积。叶面积作为植物光合作用的重要指标之一,叶面积越大,经济效益越高[22]。因此,TaEXPB12-A/B/D可作为农业分子育种中提高小麦产量的候选基因。

在低温胁迫下,植物对氧的利用效率降低,过量的氧在细胞内代谢生成活性氧(ROS)[23],从而启动氧化应激反应,包括蛋白质氧化、脂质过氧化和DNA损伤,甚至造成细胞死亡[24],使植物细胞膜的完整性丧失,而较高水平的抗氧化酶活性有助于清除植物体内的ROS,维持细胞膜的稳定性。Liu等[25]研究发现,在拟南芥中过表达新疆沙冬青(Ammopiptanthusnanus)扩展蛋白基因AnEXPA1和AnEXPA2,可增强拟南芥对低温胁迫的抗性,且转基因植株清除ROS的能力及抗氧化酶的活性也均显著提高。本研究发现,在4 ℃低温胁迫下,过表达TaEXPB12-A/B/D三个基因的拟南芥植株中SOD、POD、CAT的活性均高于野生型,且MDA的含量较低。低温胁迫下植物中某些小分子物质(如脯氨酸、可溶性糖等)的含量增加,可维持细胞渗透压,减少细胞损伤[26]。Zhang等[27]研究发现,在热、干旱、盐、镉等胁迫下,过表达白毛杨(Populustomentosa)扩展蛋白基因PttEXPA8的烟草叶片细胞电解质渗漏减少,渗透调节水平升高。本研究发现,低温胁迫下转基因拟南芥的可溶性糖、Pro的含量均高于野生型。这些结果表明,扩展蛋白基因可提高转基因植株的抗氧化能力和渗透调节能力,从而提高植株在逆境胁迫下的耐受性和存活率,推测TaEXPB12-A/B/D三个基因在清除ROS和维持膜系统的稳定性方面也发挥着重要作用。TaEXPB12-A/B/D基因参与高寒地区冬小麦的低温胁迫响应过程,其相关分子机制还需要进一步的研究。