关舒怡 田晶

摘要 产黄青霉是一种遍布于土壤、腐烂物质等基物中的真菌，可产生酶类、青霉素及有机酸等物质，是工业上用于发酵生产青霉素的重要丝状真菌。产黄青霉的菌落生长和产孢量有一定的特点，在一定程度上受到外界培养条件的影响。为筛选出产黄青霉菌的最佳培养条件，本试验以产黄青霉为研究对象，研究培养温度、光周期、培养基初始pH对产黄青霉培养的影响，以菌落直径和产孢量为指标，通过单因素及响应面试验对产黄青霉的培养条件进行优化处理。结果表明，在温度24.1 ℃、pH 7.0、光周期24 L处理时产黄青霉菌落直径最大，产孢量也最大，最适合产黄青霉菌生长，并通过试验验证该条件为最佳培养条件。

关键词 产黄青霉；响应面法；产孢量；培养条件

中图分类号 TQ465.1   文献标识码 A

文章编号 1007-7731（2023）06-0039-05

产黄青霉属无性型真菌，是一种属于半知菌亚门丝孢纲丝孢目从梗孢科青霉属的真菌，可以分泌多种胞外酶来分解底物，也可以产生真菌毒素，是工业上重要的真菌之一，也是一种遍布于土壤、空气及腐烂的有机物质等基物中的真菌[1-2]。產黄青霉是工业上β-内酰胺类抗生素的来源菌株。实际生活中，伴随着人们对青霉素的需求不断增加，产黄青霉菌株的培养可为大量获得青霉素提供物质基础。为此，本试验通过单因素及响应面试验优化得出最适合产黄青霉的培养条件，为产黄青霉的扩大培养提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种。供试菌株：产黄青霉，试管斜面保存于4 ℃的冰箱中。使用时取出活化，接种于SDAY培养基上，置于25 ℃生化培养箱中培养，当菌丝生长到培养皿2/3时，方可使用。

1.1.2 培养基。SDAY培养基：蛋白胨10.0 g，酵母粉2.0 g，葡萄糖40.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1.0 L。

1.1.3 试验器材。PHS-3CpH测试仪（上海启前电子科技有限公司）；SPX-250生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；BXM-30R高压蒸汽锅（上海博迅实业有限公司设备厂）；RXZ-280A人工气候箱（宁波江南仪器厂）；BSA224S电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；M1-L213B微波炉（广东美的厨房电器制造有限公司）；SMART生物显微镜（重庆奧特光学仪器有限公司）；HH0-C1112B超净工作台（上海智城分析仪器制造有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 产黄青霉的活化处理。配制SDAY培养基，分装灭菌后，挑取单菌落转接入装有SDAY培养液的培养皿，在恒温25 ℃下培养7～10 d，备用。

1.2.2 产黄青霉的接种。产黄青霉接种操作在超净工作台上进行，首先进行紫外消毒30 min，点燃酒精灯，用酒精对手、器皿进行消毒，在酒精灯附近进行倒平板。取菌丝生长达到培养皿2/3的SDAY培养基，在菌落中心至边缘1/2处，用6 mm的打孔器制出数块已产孢的菌饼。无菌条件下，用接种针将菌饼挑于平板培养基表面中心位置，用封口膜封住平板，并将平板倒置于培养箱中培养。

1.2.3 产黄青霉产孢量的测定。将每代菌株培养7 d后，在菌落中心至边缘1/2处，用6 mm的打孔器制出2块已产孢的菌饼，将其放入20 mL含0.05%吐温80的无菌水中，用玻璃棒搅拌3 min将其混匀，后用4层纱布过滤，最后用血球计数板计数，计算产孢量[3-5]。计算公式如下：

产孢量=N/80×4×106

式中：N表示显微镜下80个小格观察到的实际孢子数。

1.3 单因素试验

1.3.1 温度对产黄青霉培养的影响。将产黄青霉接种于SDAY培养基中，选择培养温度为15、20、25、30、35 ℃，调节初始pH值为7.0，光周期为12 L/12 D，3次重复，分别在不同的培养温度条件下培养7 d，测定产黄青霉菌落直径和产孢量。

1.3.2 初始pH对产黄青霉培养的影响。配制初始pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的培养基，按上述方法分别接种到不同培养基中，在温度为25 ℃、光周期为12 L/12 D的条件下培养7 d，3次重复。测定产黄青霉的菌落直径和产孢量。

1.3.3 光周期对产黄青霉培养的影响。按照上述方法进行接种，在温度为25 ℃、初始培养基pH为7条件下，使用人工气候箱控制光周期分别为24 D、6 L/18 D、12 L/12 D、18 L/6 D、24 L，光照强度设置为4 000 lx，培养7 d后，测定产黄青霉菌落直径和产孢量。3次重复。

1.4 响应面Box-Behnken Design设计优化产黄青霉的培养条件

在单因素试验基础上，对产黄青霉的培养进行响应面优化，运用 Box-Behnken设计试验，以单因素试验确定的培养温度、初始pH、光周期为主要考察因子，分别用A、B、C表示，并以-1、0、1分别代表自变量的高、中、低水平[6-8]。

1.5 验证试验

利用Design-Expert 10.0软件分析得到产黄青霉的最佳培养条件，在该条件下重复3次试验，验证得到的培养条件是否为最佳方案。

2 结果与分析

2.1 产黄青霉培养单因素试验的结果与分析

2.1.1 温度对产黄青霉生长的影响。如表1所示，培养温度对产黄青霉生长的影响起着关键的作用，产孢量总体较高。15～25 ℃时，随着温度的升高，菌落生长速率和产孢量逐渐增加；温度为25 ℃时，产孢量最高，之后随着温度的不断升高，产孢量开始下降；35 ℃时，菌落生长速度大幅降低。因此，当培养温度在20～30 ℃时，为产黄青霉的最适培养温度。

2.1.2 培养基初始pH对产黄青霉生长的影响。如表2所示，培养基初始酸碱度的不同会对产黄青霉的生长有一定的影响，但对产黄青霉生长的整体影响不大。从数据可分析得出：产黄青霉菌在pH为5～9的范围内都可以生长，当培养基初始pH在5～7时，产黄青霉生长的菌落直径和产孢量随着酸性的降低而增加；当培养基初始pH在7～9时，产黄青霉生长的菌落直径和产孢量随着培养基碱性的增加而减少。当培养基初始pH=7时，产黄青霉菌落直径达到最大5.33 cm，产孢量达到峰值为8.17×107 cfu·mL-1。综上所述，产黄青霉菌生长的最佳培养基初始pH为7。

2.1.3 光周期对产黄青霉生长的影响。如表3所示，产黄青霉菌在不同光周期培养的条件下，菌落的直径及产孢量有一定的差异。在光照时间为24 D～24 L时，产黄青霉菌落直径和产孢量随着光照时间的增加而增大。在光周期为24 L条件，即全光照处理时，产黄青霉菌落直径达到最大为5.70 cm，产孢量达到最多为7.64×107 cfu·mL-1。可见，当光周期为24 L时，最适合产黄青霉生长。

2.2 产黄青霉培养条件响应面试验结果及分析

2.2.1 响应面试验结果与方差分析。根据上述对培养温度、初始pH、光周期单因素试验的结果，进行Box-Behnken Design设计三因素三水平表，具體因素和水平见表4。

试验通过响应面软件的Box-Behnken得出试验方案，根据前期单因素试验结果，以产黄青霉产孢量为响应值，选取A（培养温度）、B（初始pH）、C（光周期）3个因素进行响应面优化处理，试验设计及产孢量结果见表5。

使用Design-Expert 10.0中的Analysis分析表5，得出产黄青霉的不同培养条件和产孢量之间的回归方程：产孢量Y=6.36-0.44A-0.12B+1.58C+0.09AB+0.15AC+0.15BC-0.80A2-0.63B2+0.71C2（式中：A、B、C分别为培养温度、培养基初始pH和光周期）。

依照上述拟合回归方程，应用响应面软件对产黄青霉培养条件进行方差和显著性分析。由Box-Behnken Design结果（表6）分析得出，回归方程P值为0.005 4，小于0.01，差异极显著，且失拟项（Lack of Fit）的P值为0.298 7，明显大于0.05，差异不显著，说明用该方程预测试验中培养温度、初始pH、光周期这3个影响因子与产黄青霉产孢量的关系时合理；由F值的大小可以推断出3个因子对产黄青霉产孢量的影响大小，C>A>B（52.87>4.15>0.30），即光周期对产孢量的影响最大。模型的相关系数R2=0.914 2，校正决定系数Radj2=0.803 8，则通过试验建立的模型可以表示80.38%的响应值变化。

2.2.2 响应面交互作用分析。图1～3是由试验响应值（产黄青霉产孢量）与培养温度、初始pH、光周期三者中任意2个因素所形成的等高线图和响应面曲面图，直观显示出各个因子交互作用情况下响应面的3D 和等值线分析图，可以体现培养温度、初始pH和光周期3个条件下，控制任意一个因子不变时，产黄青霉产孢量随着其他2个影响因子的变化情况。如图1～3所示，产黄青霉产孢量与培养温度（A）与初始pH（B）呈开口向下的抛物线关系，产黄青霉产孢量与培养温度（A）与光周期（C）、初始pH（B）与光周期（C）呈斜曲面的关系，通过响应面分析结果，结合光周期为24 L（全光照）情况分析可以得出：在该试验培养温度、初始pH、光周期3个因素所选取的取值范围内，存在最佳点能使产黄青霉产孢量达到最大值。由图1中分析可以明显看出，当光周期不变时，在培养温度为25 ℃，初始pH为7之前，培养温度初始pH的不断增加，产黄青霉产孢量逐渐增加，但当达到最大值后，开始逐渐减小。从响应面曲面图的坡度以及 Box-Behnken Design结果分析可得，光周期C对产黄青霉产孢量的影响比A、B更大；A对产黄青霉产孢量的影响比B大。

2.3 最佳培养条件及验证性试验结果分析

由响应面软件分析得出上述结果后，再通过numerical选项预测该试验结果的最大值，可以得到产黄青霉的最佳培养条件为：培养温度24.088 ℃，初始pH 7.015，光周期24 L，此时产黄青霉的产孢量为8.682 cfu·mL-1。充分考虑到试验条件和实际操作的可能性，将产黄青霉的最佳培养条件调整为：培养温度24.1 ℃，初始pH7.0，光周期24 L，进行3次验证试验，得出产黄青霉的产孢量为8.27×107 cfu·mL-1。该值与预测值较接近，相对误差值为4.98%，说明该模型拟合程度高，具有实用价值。

3 结论

本试验以菌落直径和产孢量为指标，在单因素试验的基础上，通过采用响应面Box-Behnken设计试验方法，得到产黄青霉的产孢量与温度、光周期以及初始pH的回归方程。试验结果表明，产黄青霉菌最优的培养条件为：培养温度24.1 ℃，初始pH7.0，光周期24 L时，此条件下产黄青霉的产孢量为8.27×107 cfu·mL-1。

4 参考文献

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（责编：张宏民）

基金项目 山西省高等学校科技创新计划项目（2021L566）。

作者简介 关舒怡（1999—），女，山西运城人。研究方向：生物学。