唐秀珍, 吴佳, 杨见伟, 林宝凤

(广西大学 化学化工学院, 广西 南宁 530004)

0 引言

银具有良好消炎、抑菌作用。自进入 20 世纪,人们逐渐广泛利用银化合物进行杀菌消毒、抗菌消炎并应用于临床上。纳米银由于量子效应、小尺寸效应和具有极大的比表面积,其抗菌性和传统的银杀菌剂相比有大幅提升,且具有安全性更高、效力持久和不易耐药等优点[1],但超大的比表面积让纳米材料具有极大的表面能,使其在应用过程中很不稳定,极易发生团聚。羧甲基壳聚糖(CMCC)作为壳聚糖的衍生物,不仅具有优良的水溶性、保湿性[2]、分散性、抗菌性、成膜性等,还有无毒、无味、生物相容性和生物降解性好等优点[3-4]。CMCC含有大量—OH、—NH2、—COOH等基团,能有效络合众多的金属离子,对较多金属纳米颗粒都具有一定的分散性能[5]。

火龙果果实外观奇特,营养丰富,绿色保健,有益于人体健康。我国火龙果种植面积持续扩大,产量逐年递增,但火龙果生理代谢旺盛,采后易染菌、腐烂,货架期短,因此火龙果贮运保鲜成为一大难题[6]。

本文利用对环境友好的天然高分子材料CMCC作为分散剂,用紫外光原位还原法[7-8]制备得到稳定分散的纳米银-羧甲基壳聚糖水溶液(NanoAg-CMCS),研究NanoAg-CMCS复合材料的结构、分散稳定性和抗菌性等性能,并初探其对火龙果的保鲜功能,旨在拓展纳米银复合材料在实际生活中的应用。

1 实验

1.1 试剂与仪器

羧甲基壳聚糖(取代度≥ 80%,上海麦克林生化科技有限公司);硝酸银(AR,南京化学试剂股份有限公司);氨水(AR,金华大化学试剂);大肠杆菌(ATCC 8739,广东省微生物菌种保藏中心);金黄色葡萄球菌(ATCC 6538,广东省微生物菌种保藏中心);自分离镰刀菌(Fusariumspp. 广西农业科学院)。

X射线衍射仪(D/max-UltimaIV型,日本理光株式会社);紫外可见光分光光度计(Alpha-1506型,上海谱元仪器有限公司;纳米粒度仪(NANO ZS90型,英国马尔文仪器公司);原子力显微镜(Inova型,德国布鲁克公司);傅立叶变换红外光谱仪(Nicolet iS50型,美国赛默世尔科技公司);高压蒸汽灭菌锅(BXM-30R型,上海博迅医疗生物仪器股份有限公司);净化工作台(VS-840-1型,上海博迅医疗生物仪器股份有限公司);数显恒温震荡摇床(SHZ-88型,常州金坛精工仪器设备有限公司)。

1.2 NanoAg-CMCS复合材料制备

将质量分数为1%的CMCS溶液与物质的量浓度为0.01 mol/L的银氨[Ag(NH3)2OH]溶液按体积比为1∶10配置混合溶液,放置在30 W紫外灯下照射2 h进行原位还原反应,混合溶液由无色变为黄色,得到NanoAg-CMCS溶液。

1.3 测试与表征

1.3.1 NanoAg-CMCS复合材料的表征

紫外-可见光光谱测试:空白样品为质量分数为1%的CMCC溶液,用紫外-可见光分光光度计对样品进行测试,扫描范围为350～800 nm。

X射线衍射分析:将NanoAg-CMCS溶液冷冻干燥为固体,研磨好,采用X射线衍射仪测试,测试条件为:Cu,Ka源,电压为40 kV,电流为20 mA,扫描范围为2θ为 5°～70°,扫描速度为5(°)/min,分辨率为0.02°。

粒径分布测试:用NANO ZS90纳米粒度仪测试NanoAg-CMCS溶液的粒径。

原子力显微镜测试:将制备好的纳米复合材料溶液各取一滴滴在云母片上,室温置于干燥器中晾干后,用Innova型原子力扫描电镜进行测试。

红外光谱测试:将所制备的NanoAg-CMCS溶液流延干燥成膜,使用傅里叶红外光谱仪对所有薄膜进行红外光谱扫描,扫描范围为4 000～500 cm-1,扫描32次,分辨率为2 cm-1

热重分析测试:将NanoAg-CMCS复合材料置于干燥器内干燥至恒定质量后,使用热重分析仪进行测试,测试时用氮气保护,升温速率为10 ℃/min,测试范围为35～800 ℃。

1.3.2 NanoAg-CMCS的抗菌性能测试

测试金黄色葡萄球菌(ATCC 6538):分别取100～700 mL的NanoAg-CMCS溶液,置于10 mL含菌体数为103cfu/mL的培养基中,摇晃均匀,置于37 ℃的恒温摇床中,在转速150 r/min下震荡培养6 h后,以含菌体数为103cfu/mL的培养基作为空白溶液,用紫外-可见光分光光度计测定各培养基在600 nm的吸光度A。

测试大肠杆菌(ATCC 8739):分别取100～1 100 mL的NanoAg-CMCS溶液,置于10 mL含菌体数为103cfu/mL的培养基中,摇晃均匀,置于37 ℃的恒温摇床中,在转速150 r/min下震荡培养6 h后,以含菌体数为103cfu/mL的培养基作为空白溶液,用紫外-可见光分光光度计测定各培养基在600 nm的吸光度A。

测试镰刀菌(Fusariumspp.):在已灭菌的平板中接种1 mL含菌体数为108cfu/mL镰刀菌菌液,然后倾注约20 mL已冷却至50 ℃左右的马铃薯葡萄糖琼脂培养基,混合均匀,水平静置凝固后用打孔器打孔,在空白组和NanoAg-CMCS组的固体培养基的孔中分别加入30 μL的蒸馏水和NanoAg-CMCS水溶液,置于30 ℃恒温培养箱中培养48 h后,用游标卡尺测试抑菌圈直径。

1.3.3 NanoAg-CMCS静置聚沉实验

将所制备的NanoAg-CMCS水溶液和NanoAg水溶液超声处理后,取相同体积放置在相同容器中,在常温下静置,取静置了不同时长的NanoAg-CMCS溶液和NanoAg溶液样品上清液,用紫外可见光分光光度计测试样品在416 nm的透过率,同时对不同放置时长后样品的状态进行拍照记录和观察。

1.4 火龙果保鲜实验

广西佳年农业有限公司提供软枝大红火龙果。

火龙果的处理:当日采摘的新鲜果,挑选无机械损伤,外观完好的火龙果进行实验。将火龙果用清水洗涤晾干,空白组不做处理,NanoAg-CMCS组用稀释10倍的NanoAg-CMCS涂膜,晾干,将两者放置于27 ℃,相对湿度为80%的培养箱中保存。

失质量分数率测定:将处理好后的果实称重,得果实初始质量为m0,记为原质量,第n天称量得到的果实质量为mn,失质量分数率w按下式计算:w=(m0-mn)/m0×100%。

呼吸强度测定[9]:采用静置碱液吸收法测呼吸强度,定量碱液吸收火龙果在一定时间内呼吸所释放出来的CO2,再用酸滴定剩余的碱,即可计算出呼吸所释放出来的CO2量,求出其呼吸强度,单位为mg·(kg·h-1)。

火龙果外观:用相机记录放置不同时间后,火龙果外观的变化。

2 结果与讨论

2.1 NanoAg-CMCS复合材料的表征

NanoAg-CMCS复合材料的表征结果如图1所示。

图1 NanoAg-CMCS复合材料的表征结果Fig.1 Characterization of NanoAg-CMCS composites

由图1(a)可知,与UV照射前的Ag(NH3)2OH-CMCS溶液的紫外吸收光谱图对比,UV照射后的NanoAg-CMCS溶液的在416.5 nm左右出现了强吸收峰,而NanoAg材料的紫外吸收峰一般在380～450 nm[10]。由图2(b)可知,UV照射前的[Ag(NH3)2OH]溶液,存在Ag+的特征峰(28.46°、32.42°、46.49°、54.92°、57.44°),经过UV照射,原位还原后样品中的Ag+的特征峰消失,出现了单质金属银的特征峰,(37.97°、44.21°、64.1°)[11],说明[Ag(NH3)2OH]溶液中Ag+通过紫外照射原位还原生成为单质银。由图1(c)可知,NanoAg-CMCS在27.96、145.8 nm左右都有分布,其平均粒径为134.6 nm,且由图1(d)可见,分布在云母片上纳米银直径在20～200 nm,高度只有3.5 nm,与粒径的测试结果相符。由图1(e)可知, 2 913.9 cm-1(C—H)、1 596.8 cm-1(二级胺)、1 425.1 cm-1(CH2)、1 309 .4 cm-1(C—N)、10 64.5 cm-1(C—O)是属于CMCS的特征峰[2],NanoAg-CMCS的红外谱图中,并没有出现新的特征峰,说明添加纳米银并没有改变CMCS的分子链的化学结构,但相对于CMCS空白样品的谱图, NanoAg-CMCS特征峰的位置均发生了细微的偏移,说明纳米银虽然没有改变CMCS的分子链结构,但是金属银的孤对电子与CMCS的—OH、—NH2、—COOH等基团存在静电吸引力作用,导致CMCS的特征峰出现偏移的情况。

由图1(f)可知,NanoAg-CMCS的分解温度为267.4 ℃,与CMCS空白组的分解温度264.1 ℃相比上升了3.3 ℃,即NanoAg-CMCS比CMCS空白样的热稳定性要高,进一步证明银的孤对电子与CMCS的—OH、—NH2、—COOH存在一定的静电吸引力作用,从而提高了复合材料的热稳定性能。

2.2 NanoAg-CMCS复合材料分散稳定性

NanoAg-CMCS复合材料分散稳定性如图2所示。

(a) 静态沉降试验

(b) 紫外透过率-时间图

由图2可知,放置2 h后,银粒子水溶液[图2(a)样品A]出现明显的聚沉现象,紫外可见光透过率从75%上升至90%;放置12 h后,大部分银粒子聚沉,紫外可见光透过率为97%;放置24 h后,银粒子全部聚沉,紫外可见光透过率为100%;放置720 h后,NanoAg-CMCS水溶液[图2(a)样品B]依然没有发生明显的聚沉现象,溶液均匀透明 ,紫外可见光透过率仅上升0.5%,NanoAg稳定的分散在水溶液中。说明CMCS的加入,大幅度提升了NanoAg在水溶液中的分散稳定性能。

2.3 NanoAg-CMCS复合材料的抗菌性能

NanoAg-CMCS复合材料的抑菌性能如图3所示。由图3(a)可见,NanoAg-CMCS水溶液在样品体积分数为6% 以上时能完全抑制金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)的生长,即对金黄葡萄球菌(ATCC 6538)的最低抑菌浓度M(S.aureus)为6×10-2mg/L;由图2(b)可知,NanoAg-CMCS水溶液在样品体积分数大于9%时,能完全抑制大肠杆菌(ATCC 8739)的生长,即M(E.coil)为9×10-2mg/L;由图3(a)、(b)中2组培养基图片可见,加入NanoAg-CMCS的培养基相对于空白组(CMCS)澄清透明,说明NanoAg-CMCS具有良好的抗菌性能。

镰刀菌(Fusariumspp.)是引起火龙果腐败的主要原因之一[12-13],通过抑菌圈实验测试[图3(c)]可见,和空白组(CK)的抑菌圈直径为0 mm相比,NanoAg-CMCS组(EG)的抑菌圈直径为22.41 mm,结果表明NanoAg-CMCS对镰刀菌具有较好的抑菌效果。

图3 NanoAg-CMCS复合材料的抑菌性能Fig.3 Antibacterial properties of NanoAg-CMCS composites

2.4 火龙果保鲜实验

火龙果保鲜实验结果如图4所示。

图4 火龙果保鲜实验结果Fig.4 Experimental results of preservation of pitaya fruit

由图4(a)可知,空白组(CK)第6天鳞片出现明显的枯黄腐败现象,NanoAg-CMCS组(EG)没有出现明显的枯黄现象;第10天,EG组也出现了腐败情况,CK组鳞片大量枯黄。由图4(b)可知,相对于CK组,EG组明显减少了果柄水分的流失,缓解果柄的脱水干枯现象;由图4(c)可知,EG组的质量分数下降明显,相对于CK组,减小了20%左右;由图4(d)可见,相对于CK组,用NanoAg-CMCS涂膜处理后的火龙果的呼吸强度明显降低,火龙果保鲜的中后期呼吸强度减小至少20%。综上,NanoAg-CMCS涂膜处理延缓火龙果鳞片黄化和果柄的失水,使火龙果存储时间延长3 d,有利于火龙果的保鲜。

3 结论

本文采用便捷绿色的方法成功制备了NanoAg-CMCS复合材料,结果表明,CMCS和NanoAg之间可能存在静电引力作用,CMCS的加入提高了NanoAg水溶液的分散稳定性。所制备的NanoAg-CMCS复合材料有良好的稳定性,对镰刀菌(Fusariumspp.)具有较好抑菌性能,用于火龙果的保鲜时,能降低火龙果的失重率和呼吸强度,延迟火龙果出现腐败、枯黄出现的时间,有一定的保鲜作用。本研究为防止NanoAg的团聚,提高其水溶液的分散稳定性提供了新思路和方法,为NanoAg在水果保鲜方面的研究提供依据,拓展了纳米银材料的应用领域。