刘 征,宫向良,于大中,赵艳云,徐爱芳,宋 杨

(1.唐山市人民医院 检验科,河北 唐山063000;2.唐山市第三医院 肿瘤科,河北 唐山063100)

胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤。随着生活压力的增加与饮食结构的改变,胃癌的发生逐渐趋于年轻化,与遗传因素、高钠饮食和幽门螺旋杆菌感染等有密切关系[1-3]。胃癌早期并无明显临床症状,难以引起重视,因此多数患者确诊时,病情已经发展到中、晚期,错过了最佳治疗时期。化疗是目前临床治疗胃癌的重要手段,虽然可以延长患者生存期,但预后不佳[4]。含奥沙利铂的化疗方案在治疗胃癌晚期中的疗效已经得到公认[5],奥沙利铂是第三代铂类药物,可以通过破坏肿瘤细胞中脱氧核苷酸的方式抑制其生长[6]。但长期化疗仍会引起肿瘤细胞耐药,降低治疗效果[7]。因此寻找影响奥沙利铂化疗的分子机制,对针对性靶向治疗胃癌具有重要意义。

磷脂酰肌醇3激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)通路是肿瘤细胞中最常见的信号通路之一,它参与调节细胞的增殖、生长、存活、迁移和代谢,在胃癌等多种肿瘤细胞中呈现异常高表达,是细胞耐药相关的关键通路[8]。Ⅱ型多磷酸肌醇4-磷酸酶(INPP4B)是一种肿瘤抑制因子,可以抑制PI3K表达,阻断PI3K/AKT传导[9]。有研究表明[10],INPP4B在乳腺叶状肿瘤组织中的表达高于正常组织。另有研究指出[11],下调INPP4B可以阻断PI3K/AKT传导,抑制前列腺癌的细胞增殖与迁移。INPP4B在多种肿瘤细胞均出现异常表达,且可能靶向调控PI3K/AKT信号通路基因表达。由此可以推测,INPP4B及其调控的PI3K/AKT信号通路可能通过影响癌细胞恶性行为学从而参与胃癌化疗过程。为探讨INPP4B和PI3K/AKT通路在晚期胃癌患者的临床病理特征和化疗敏感性的关系,本研究选取79例晚期胃癌患者为研究对象,为临床晚期胃癌开展针对性靶点治疗提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采取率样本量计算公式估算总体样本量,校验水准α=0.05,把握度1-β=0.9,以胃癌化疗敏感率为指标,查阅文献胃癌化疗敏感率取P1=0.4,计算得到样本量为67例,考虑15%的失访率,最终取样本量79例。N=2(Zα/2+Zβ)2(P0q0+p1q1)/(P0-P1)2。选取2018年12月至2019年12月医院收治的79例晚期胃癌患者作为研究组,其中男性39例,女性40例;年龄31～69岁,平均年龄(50.74±7.61)岁;TNM分期ⅢB期48例,Ⅳ期31例。纳入标准:①符合《AJCC胃癌TNM分期系统(第8版)》[12]中胃癌晚期诊断标准者;②经病理学检验确诊为胃癌晚期者;③临床分期为TNM分期ⅢB或Ⅳ期[12];④影像学检查有可测量病灶;⑤不可手术切除者或接受手术治疗后复发转移者;⑥Karnofsky(KPS)评分[13]≥70分者;⑦预计生存期≥3个月;⑧年龄18～80岁;⑨知情且同意参与研究。排除标准:①化疗禁忌症者;②伴胸腹水、弥漫性肝浸润等无法进行影像学测量病灶者;③合并其他部位原发性恶性肿瘤者;④合并严重心脑血管疾病者;⑤合并完全性肠梗阻者;⑥严重过敏体质者;⑦依从性差者;⑦合并精神病或无法交流者;⑧正在参与其他临床研究者。另外选取与研究组性别、年龄匹配的健康体检者40例作为对照组,其中男22例,女18例;年龄28～65岁,平均年龄(48.78±6.05)岁。经检验研究组与对照组人员的年龄与性别具有可比性(P>0.05)。本研究通过医院医学伦理委员会审批。

1.2 研究方法

1.2.1治疗方案

第1天:静脉注射奥沙利铂(注射用奥沙利铂,50 mg/瓶,国药准字H20093167,齐鲁制药有限公司)130 mg/m2;第1～14天:口服卡培他滨(希罗达,0.5 g×12片,国药准字H20073024,上海罗氏制药有限公司)2 000 mg/(m2·d),2次/d。每3周为1个治疗周期,根据患者情况治疗至病情进展或不能耐受化疗副作用。

1.2.2化疗敏感性评价

化疗2个周期后根据《实体瘤的疗效评价标准1.1(RECIST 1.1)》[14]对近期疗效进行评估,根据疗效情况分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、疾病稳定(SD)与疾病进展(PD);其中CR即表示目标病灶完全消失,PR即表示所有可测量目标病灶长径总和缩小≥30%,PD即表示所有可测量目标病灶长径总和增加≥20%,SD即表示可测量病灶长径总和改变处于PR和PD之间;将评价为CR与PR的患者记为敏感组,评价为SD与PD的患者记为抵抗组。

1.2.3外周血INPP4B与PI3K/AKT信号通路mRNA表达检测

化疗前,采用真空采血管(含抗凝剂)采取对照组与研究组人员清晨空腹外周静脉血5 mL,保存于-80℃超低温冰箱中备用。采用Trizol法(产品货号:RP2401,深圳辉诺生物科技有限公司)提取全血中总RNA,采用Qubit检测RNA浓度,取适量RNA进行逆转录(产品货号:11142ES10,上海翌圣生物科技有限公司)生成cDNA,以生成的cDNA为模板链,加入表1中引物进行实时荧光定量PCR(产品货号:Q105,南京巨匠生物科技有限公司),反应条件如下:(1)预变性:95℃(5 min)×1个循环数;(2)循环反应:[95℃(5 s)+60℃(20 s)]×45个循环数。以β-actin为内参基因,根据2-△△CT计算INPP4B、PI3K和AKT的相对表达量,每个样品重复检测3次。引物序列见表1。

表1 INPP4B、PI3K、AKT与β-actin的上下游引物序列

1.2.4患者临床病理特征与随访

统计所有研究组患者的临床资料,包括性别、年龄、TNM分期、肿瘤位置、病理类型、病灶个数和分化程度等。采用电话或复诊方法进行随访,随访2年,以患者全因死亡或随访时间截止为终点事件。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 研究组与对照组外周血INPP4B表达水平比较

研究组外周血中INPP4B mRNA的相对表达量低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 研究组与对照组外周血INPP4B表达水平比较

2.2 外周血INPP4B与晚期胃癌患者临床病理特征的关系

根据研究组中INPP4B mRNA表达水平的中位数进行分组,≥0.25的为高表达组,共40例;<0.25的为低表达组,共39例。

不同性别、年龄、肿瘤位置、病理类型、病灶个数和分化程度的胃癌患者外周血INPP4B mRNA高表达和低表达的占比经比较,差异不具有统计学意义(P>0.05);Ⅳ期胃癌患者外周血INPP4B mRNA低表达占比高于ⅢB期患者,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 外周血INPP4B与晚期胃癌患者临床病理特征的关系

2.3 敏感组和抵抗组外周血INPP4B、PI3K与AKT mRNA表达水平

79例患者均完成2个及以上化疗周期,其中CR 1例,PR 30例、SD 33例、PD 15例,敏感组共31例,占39.24%;抵抗组共48例,占60.76%。抵抗组的INPP4B mRNA表达水平低于敏感组,抵抗组PI3K和AKT mRNA表达水平高于敏感组(P<0.05)。见表4。

表4 敏感组和抵抗组外周血INPP4B、PI3K与AKT mRNA表达水平比较

2.4 外周血INPP4B水平与PI3K/AKT信号通路的相关性分析

化疗前,研究组胃癌患者外周血INPP4B mRNA表达水平与PI3K和AKT mRNA表达水平呈负相关(r=-0.551、-0.312,P<0.05)。见图1。

图1 外周血INPP4B水平与PI3K/AKT信号通路的相关性分析

2.5 INPP4B的表达与生存期分析

随访24个月,其中高表达组2例失访,低表达组1例失访,随访率96.20%。高表达组与低表达组的中位生存时间为12.00个月(95%CI:10.515～13.954)和11.00个月(95%CI:10.046～12.794),2组累积生存曲线差异具有统计学意义(Logrankχ2=7.669,P=0.006)。见图2。

图2 外周血INPP4B水平对晚期胃癌总体生存曲线的影响

3 讨论

含奥沙利铂的化疗治疗方案在临床上具有广泛应用。奥沙利铂进入机体后可以迅速与肿瘤细胞中的DNA形成链间和链内交联,抑制DNA复制与合成,从而达到抗肿瘤的作用[15]。但随着治疗的推进,胃癌细胞对奥沙利铂的耐药逐渐显现,治疗效果降低。因此寻找胃癌细胞药物敏感的分子生物学靶点具有重要的临床意义。INPP4B可促进PI(3,4)P2的D4磷酸基团发生去磷酸化生成为3磷酸磷脂肌醇[PI(30)P],阻断PI3K/AKT通路传导,抑制肿瘤细胞增殖,且有研究显示,INPP4B在部分肿瘤细胞中呈低表达[16]。因此本文对INPP4B和PI3K/AKT通路在晚期胃癌患者的临床病理特征和化疗敏感性的关系进行探究,以期为临床晚期胃癌开展针对性靶点治疗提供参考依据。

INPP4B位于染色体4q31.21上,编码蛋白分子量约为110 kDa,其表达水平与前列腺癌、乳腺叶状癌等众多肿瘤的发生发展相关[10-11]。本研究结果显示,研究组外周血中INPP4B mRNA的相对表达量低于对照组,Ⅳ期胃癌患者外周血INPP4B mRNA低表达占比高于ⅢB期患者,提示外周血INPP4B mRNA的相对表达量在胃癌晚期患者中呈低表达,且表达水平与胃癌晚期TNM分期有关。Wang等研究显示[17],INPP4B在多发性骨髓瘤细胞中表达低于正常浆细胞。苗玉等研究显示[18],INPP4B在正常乳腺组织中表达高于乳腺癌组织,且其表达水平与随着TNM分期升高而降低。以上研究和本研究结果共同说明,INPP4B在肿瘤患者中的低表达状态与肿瘤病理特征有关,并且可能参与病情进展。

AKT是一种蛋白激酶,在肿瘤的发生发展中具有重要作用。PI3K/AKT通路是调控细胞增殖、凋亡、自噬等生物学过程的关键通路,目前已成为化疗敏感性机制研究的热点。高度激活的AKT会形成pAKT,调节含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9等靶蛋白,起到抗细胞凋亡的作用,降低肿瘤细胞的化疗敏感性,促使患者对化疗耐受。本研究结果显示,抵抗组的INPP4B mRNA表达水平低于敏感组,抵抗组PI3K和AKT mRNA表达水平高于敏感组,化疗前研究组胃癌患者外周血INPP4B mRNA表达水平与PI3K和AKT mRNA表达水平呈负相关,提示胃癌晚期患者外周血INPP4B表达水平与化疗敏感性有关,且INPP4B可能通过负调控PI3K/AKT通路实现改变癌细胞对化疗药物的敏感性。张玉清等研究显示[19],下调PI3K/AKT通路的表达可以降低宫颈癌细胞对化疗药物的耐药性。说明PI3K/AKT通路是参与调控癌细胞化疗药物敏感性的关键通路。细胞实验显示[20],在人急性髓细胞白血病THP-I细胞系中过表达INPP4B可以抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,降低细胞凋亡率。临床研究显示[16],INPP4B在肝癌组织中表达低于正常组织,且INPP4B高表达可以抑制肝癌细胞凋亡,增加其化疗敏感性。以上研究表明,INPP4B可能是胃癌细胞化疗敏感性的重要靶基因。此外,本研究结果发现,高表达组与低表达组的中位生存时间为12.00个月和11.00个月,2组中位累积生存曲线经比较具有统计学意义,提示INPP4B表达水平对晚期胃癌患者生存预后产生影响。以上研究和本研究共同说明,高表达INPP4B可能会抑制下游PI3K/AKT通路,起到促进肿瘤细胞凋亡的作用,使化疗敏感性增加,有利于延长患者生存期。

综上,外周血INPP4B与胃癌晚期TNM分期、化疗敏感程度及预后生存有关,且INPP4B调控化疗敏感性的机制可能与负调控PI3K/AKT通路有关,为临床晚期胃癌开展针对性靶点治疗提供参考依据。但INPP4B在胃癌细胞中的分子生物学机制仍需开展细胞学及动物学研究进行深入探讨。