肖君瑶 钟耕瑞 王汉琴 王正艳 涂明利

结核性胸膜炎及肺癌为我国常见病,多并发胸腔积液,早期诊断较困难。原癌基因蛋白质c-Pim-1(Pim-1)是一种原癌基因, 已证实与多种肿瘤表达相关[1]。近年有研究显示Pim-1与多种炎性疾病相关[2-4]。 Pim-1激酶对结核免疫中的淋巴及巨噬细胞等均有调控作用[5-6]。抑制Pim-1表达可抑制NF-κB p65的表达并阻断炎症启动[3,7]。前期研究显示结核性胸水中Pim-1的表达高于癌性,胸水Pim-1有利于良恶性胸水的鉴别[8]。但二者胸水Pim-1的差异性表达尚不能确定来源,且缺乏组织学证据及相关蛋白水平定量研究。本文通过免疫组化及Western-Blot方法分析了21例结核性胸膜炎,20例肺癌胸膜组织中Pim-1蛋白的分布及表达水平,并探讨了与Pim-1表达相关的临床因素,为验证Pim-1的鉴别价值,寻找结核性胸膜炎及肺癌的病因学诊断指标及治疗靶点打下基础。

资料与方法

一、一般资料

收集我院2021年1月-2021年11月内科胸腔镜手术切除的确诊结核性胸膜炎及肺癌的胸膜活检标本共41例,其中男性28例,占68.3%(28/41),女性13例,占31.7%(13/41),年龄19～85岁,平均年龄(56.5±2.4)岁,两组一般临床资料无明显差别(P>0.05)。所有病例均经组织病理学证实并有完整的病理学资料,术前均未接受任何抗结核治疗及放化疗。其中结核性胸膜炎组21例(51.2%);肺癌组20例(48.8%),包括腺癌16例(39.0%),鳞癌3例(7.3%)和小细胞肺癌1例(2.5%)。根据UICC2009版的肺癌TNM分期进行病例分期均为Ⅳ期,其中根据影像学检查提示有淋巴结转移14例(70.0%),无淋巴结转移6例(30.0%),肿瘤直径≤3cm有13例(65.0%),肿瘤直径>3cm有7例(35.0%)。胸腔镜下胸膜活检组织标本分为2份,一份在-80℃冰箱冻存用于Western-Blot检验;一份用4%多聚甲醛通用型组织固定液,并常规石蜡包埋,切片厚4 μm,用于免疫组化染色。本研究获得院伦理会批准(医科伦审 2021第01号)。

二、方法

1 主要试剂

兔抗Pim-1单克隆抗体购于美国Novus Biologicals公司;兔IgG免疫组化SABC即用型试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司;GAPDH购于美国Proterintech公司。

2 免疫组织化学染色

将4 μm石蜡切片常规进行脱蜡、乙醇脱水,3%过氧化氢孵育10min,PBS热抗原修复,5%BSA封闭后磕掉,一抗兔抗Pim-1单克隆抗体稀释度为1:100,各步间均以PBS替代一抗为阴性对照,37℃孵育1h,PBS冲洗,加二抗37℃孵育30min,冲洗后加SABC,37℃孵育30min,DAB显色剂显色,显微镜下判断染色程度,苏木素复染,中性树脂封固。

3 免疫组化结果判定

随机选5个高倍镜视野,计数100个细胞。先按染色强度打分:0分为无色,1分为浅黄色,2分为黄色,3分为棕黄色或棕褐色,染色强度与背景着色进行对比。再按表达阳性细胞的百分比打分:0分为阴性,1分为阳性细胞≤10%,2分为11%～50%,3分为51%～75%,4分为>75%。两者积分相乘≤1分记为阴性;积分相乘>1分为阳性,其中2～4分为弱阳性,5～8分为中等阳性,强阳性为9～12分,阳性率(%)=[1-(阴性例数/总例数)]×100%。

4 Western-Blot法检测Pim-1蛋白表达水平

取冻存的胸膜组织,液氮冻融,每孔加入200 μL含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取蛋白,检测蛋白浓度后加入缓冲液定量,取10 μg蛋白。根据常规方法进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳并进行转膜,使用5% BSA封闭1 h,一抗4℃孵育过夜(一抗稀释比均为1:1000),TBST洗涤后二抗室温孵育2 h,再次洗涤后使用化学发光法检测目的条带并使用Image J软件对条带进行灰度分析。

三、统计学方法

结 果

一、Pim-1表达的形态学特点

显微镜下可见阳性染色为淡黄色,棕黄色,棕褐色,染色程度不等。Pim-1表达在细胞的细胞核和细胞质中,呈弥漫性分布,以微血管周围分布较为密集。结核性胸膜炎胸膜组织阳性染色及阴性对照(见图1),图1A由上往下箭头标注处分别为阴性染色、棕褐色、棕黄色及淡黄色;肺癌胸膜组织阳性染色及阴性对照(见图2),(图2A)由上往下箭头标注处分别为淡黄色及阴性染色。

图1 结核组胸膜组织Pim-1蛋白表达(免疫组化,×200)注:A:阳性表达 B:阴性对照

图2 肺癌组胸膜组织Pim-1蛋白表达(免疫组化,×200)注:A:阳性表达 B:阴性对照

二、Pim-1在结核性胸膜炎及肺癌组中的表达情况

在21例结核性胸膜炎组中,Pim-1强阳性表达的有7例,中等阳性6例,弱阳性7例,阴性1例,阳性率为95.24%,95%CI(0.762～0.999);在20例肺癌组中,Pim-1中等阳性2例,弱阳性12例,阴性6例,阳性率为70.00%,95%CI(0.457～0.881)。两组差异有统计学意义(P<0.001)(见表1)。

表1 Pim-1在结核性胸膜炎(结核组)和肺癌组织的表达情况[n(%)]

三、Pim-1表达与临床指标的关系

肺癌组中,Pim-1的表达与是否存在淋巴结转移具有明显相关性,而与性别、吸烟史、BMI、肿瘤大小及病理分型无明显相关性。结核组中,Pim-1的表达与性别、吸烟史及BMI水平无明显相关性。详(见表2和表3)。

表2 肺癌组Pim-1的表达与各项临床指标的关系[n(%)]

表3 结核组Pim-1的表达与各项临床指标的关系[n(%)]

四、Western-Blot法检测结核性胸膜炎及肺癌组Pim-1蛋白表达水平

Western Blot结果显示,相较于肺癌患者,Pim-1蛋白在结核性胸膜炎患者的肺组织中表达水平较高,t=4.457,P<0.01 ) ,差异具有统计学意义(详见图3和图4)。

图3 Western Blot检测肺癌组及结核组Pim-1表达水平

图4 肺癌组及结核组Pim-1表达水平差异注:**与肺癌组相比,P<0.01

讨 论

近年来传染病的防治在我国尤为重视,且我国肺结核疫情依旧严峻,为全世界结核高负担国家之一,2018年新发结核82.3万例[9]。结核性胸膜炎是临床上常见的结核类型,发病数量有明显上升趋势,国内报道住院患者中3.5%为结核性胸膜炎[10]。肺癌又是我国常见的高发癌症,据统计,癌症死亡的最常见原因是肺癌,全球每年约179万人死于肺癌[11],当肺癌被发现时绝大部分已经有转移[12],所以寻找病因学诊断指标及可能存在的治疗靶点对早诊早治显得极为重要。

Pim-1最早作为莫洛尼小鼠白血病病毒的前病毒插入点被发现,分布广泛,44Ku Pim-1主要存在于细胞膜,34Ku Pim-1在细胞质和细胞核中都有发现[13],其编码产物是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,在肿瘤发生发展中起到重要作用,实验发现其在骨肉瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤等恶性肿瘤疾病中均有高表达[14-15]。Kim等[16]发现Pim-1基因的T-C-T-C单元型可以使肺癌的发病率增高。有研究显示肺癌组织中Pim-1的表达要高于正常组织,且染色强度与肿瘤疾病的发展有关[17]。同时Pim-1通过各种通路在炎性疾病中也发挥着调控作用,许多慢性炎症相关疾病被证实有Pim-1的参与,Vries等[18]发现,Pim-1激酶有抗过敏性哮喘的作用,Shen等[3]研究发现Pim-1激酶参与了黏膜损伤炎症反应,可能成为治疗炎性肠病的一种新靶点。使用SiRNA及抑制剂阻断NF-κB信号可以抑制Pim-1蛋白的表达及抑制蛋白活性[19]。Pim-1可以使p65 Ser276位点磷酸化,敲除Pim-1可以抑制NF-κB降低炎性因子合成,阻断炎症启动的恶性循环[7]。结核感染过程中通过各种信号通路来调控机体免疫应答,其中Morris等[20]发现炎性因子刺激小鼠的巨噬细胞,NF-κB通路被激活释放NO和诱导型NO合酶促进机体对结核分枝杆菌的清除。但目前对Pim-1与结核病的相关研究较少,前期研究发现结核性胸腔积液中Pim-1的表达高于癌性胸水,对良恶性胸水有鉴别意义,提示Pim-1可能成为一种新的诊断指标[8]。因此对胸水中Pim-1的可能来源,Pim-1在结核性胸膜炎及肺癌胸膜组织中表达情况及蛋白水平差异的进一步探索研究显得颇为重要。

本实验结果表明,Pim-1在结核性胸膜炎胸膜组织的蛋白表达要高于肺癌胸膜组织,结核性胸膜炎组中Pim-1阳性率为95.24%,肺癌组中Pim-1阳性率为70.00%,差异有统计学意义,且Western-Blot法检测结核性胸膜炎组Pim-1蛋白表达水平也高于肺癌组,因此猜想结核性胸膜炎胸腔积液中Pim-1的高表达,可能与结核性胸膜炎中结核感染过程中的多种炎性因子刺激胸膜组织上Pim-1高表达相关。在胸膜组织高表达Pim-1的基础上,胸膜炎症及毛细血管滤过性增加从而导致胸腔积液中Pim-1的表达增高,但这些有待于进一步完善研究证实。Pim-1有调控细胞增殖、分化、凋亡等重要作用,同时也参与炎性疾病的免疫过程。本实验结果进一步验证了结核性胸膜炎患者胸水和胸膜组织中Pim-1检测的价值,并探索了结核性胸水中高表达的Pim-1可能来源,Pim-1很有可能成为结核性胸膜炎与肺癌的一种新的病因学诊断指标,甚至是未来治疗的靶点,且两者相较胸水Pim-1检测更方便快捷,对患者创伤更小,临床应用更有优势。而两组间Pim-1的表达与临床因素的探讨,后续可纳入更多、更全面的指标进行补充。Pim-1与炎性疾病相关探讨日渐丰富,Pim-1与结核性胸膜炎的发病机制的关系也值得我们进一步探索。