王慧 邵青 张燕 王文杰 杨苗苗 胡婕雯 张玲

(1.西安市精神卫生中心,陕西 西安 710061;2.西安交通大学附属红会医院,陕西 西安 710000)

苦豆子[1]为豆科植物苦豆子的种子,是西北很普遍的一种很重要的药植资源。该品具有清热去火,抑菌消炎等功效[2],常用于胃痛,宫颈糜烂,湿疹,顽癣等疾病。由于其不易透过皮肤一定程度制约了其外用制剂的开发与应用。

乙醇脂质体[3]含有较高浓度乙醇,在传递过程中使脂质体易变形,较易携带药物进入皮肤深层,显著增加药物的渗透性,但由于乙醇易挥发,长期放置药物容易泄漏,很大程度上限制了其在药物研发中的应用。如果在乙醇脂质体制备过程中加入丙二醇[4-5],可能会因为粘度增大,从而增加乙醇脂质体的稳定性,鉴于此,本实验在制备乙醇脂质体显著提高苦豆子总碱的透皮量的基础上,在处方中加入了丙二醇,制备二元醇脂质体,并对其包封率、体外透皮率、囊泡进入皮肤的深度及稳定性进行考察,筛选出乙醇与丙二醇的最佳配比。

1 仪器与材料

1.1仪器 LCZA型高效液相色谱仪系统(日本岛津);Leica Tcs SpⅡ型激光共聚焦显微镜(德国徕卡有限公司);RC-3B型药物溶出仪(天津市精拓仪器科技有限公司);TG20M型高速离心机(湖南郝西仪器设备有限公司),TK-12B型透皮扩散实验仪(上海罗中科技发展有限公司)。

1.2试药 苦豆子总生物碱原料药(批号:040228,含量99.8%,宁夏紫荆花药业);槐定碱标准品(批号:040228,食品药品研究所);卵磷脂(PC上海爱康精细化工有限公司,含量90%);罗丹明B(Sigama公司);透析袋(截留分子量5000～8000,北京鹏成生物所分装);甲醇是色谱纯(Dima公司)。

1.3动物 昆明种小鼠,体重(20±4)g(许可证号SCXK(甘)14-006,合格证:医动字第14-006号,兰州大学动物实验中心)。

2 方法

2.1制备二元醇脂质体 精密称取3%(W/V)的苦豆子总碱、3%(W/V)PC和0.03%(W/V)罗丹明B溶于4.5 mL醇溶液中(乙醇∶丙二醇为10∶0,9∶1,7∶3,5∶5,3∶7,1∶9和0∶10,w/w),将PBS(pH 6.5)5.5 mL缓慢注入,整个过程在密闭恒温容器中以700 r·min-1的转速不断搅拌20 min,制备过程中保持体系在(30±1)℃,室温冷却30 min,过滤[6],得不同比例乙醇与丙二醇的醇脂质体。

2.2苦豆子总碱中槐定碱的含量测定

2.2.1色谱条件 色谱柱:Kromasil C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相:三乙胺-甲醇-0.05mol·L-1磷酸二氢钠(0.1∶20∶80);检测波长:210 nm;柱温:30 ℃,进样量:10 μL。

2.2.2标准曲线及线性范围 精密称取6 mg的槐定碱标准品,置于10 mL容量瓶中,加甲醇溶液并定容,得对照品。精密量取该对照品,用甲醇将其稀释成不同浓度的溶液(0.625、1.25、2.5、5、10和20 μg·L-1)。按“2.2.1”项下色谱条件,进样分析,以峰面积(A)对浓度(C)进行回归,线性回归方程A=19448C+9811,r=0.9999,表明槐定碱在20～0.625 μg·L-1内与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.3精密度及回收率试验 精密量取槐定碱上述对照品,用甲醇将其稀释成高、中、低(20、10、5 μg·L-1)的质量浓度的对照品溶液,测日内精密度(同日测定5次);测日间精密度(连续测定5 d)[7-8]。结果,平均日内及平均日间均小于5%(n=5),表明该方法精密度良好。计算样品溶液的平均回收率为:(99.37±2.31)%,RSD小于2.62%,表明该方法回收率良好。

2.3醇脂质体形态的测定 将制得的二元醇脂质体样品稀释后,滴至有支持膜的铜网上,磷钼酸染色后,室温挥干,透射电镜下观察醇脂质体形态。

2.4粒径及Zeta电位 将制得的二元醇脂质体以0.45 μm微孔滤膜过滤,激光动态光散射仪检测样品的粒径大小及Zeta电位。

2.5包封率的测定 精密量取1 mL苦豆子总碱醇脂质体,加无水乙醇,超声5 min,使醇脂质体完全破乳,无水乙醇稀释到合适浓度,微孔滤膜过滤,HPLC法测定滤液,所测的药物总浓度为C,将精密量取的等比例的醇相缓冲盐体系溶液2 mL放于透析袋内作为内相,将精密量取的苦豆子总碱醇脂质体10 mL放于透析袋外作为外相,以500 r·min-1,(35±2)℃透析6 h[9-10]。精密量取1 mL透析袋内透析液,用等比例的醇相缓冲盐溶液稀释,微孔滤膜过滤,HPLC法测定滤液,所测的游离药物浓度为CⅠ,计算不同比例乙醇与丙二醇的醇脂质体的包封率(EE%)为:EE%=(C-CⅠ)/C×100%。

2.6不同比例乙醇与丙二醇的醇脂质体的体外经皮渗透实验的比较 采用Franz扩散池进行小鼠皮肤的渗透研究,取昆明小鼠,用剃刀小心地刮去背部毛发,从每只被处死的小鼠背部区域切除一块皮肤,清洗,浸泡于生理盐水,4℃保存,备用。给药室上固定小鼠皮肤,在接收池中加入一定量的磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4),使得小鼠皮肤与接收液完全接触。取醇脂质体各0.5 mL,滴于给药室上的小鼠皮肤,以500 r·min-1的速度搅拌恒温水浴池(35±2)℃,分别在0,1,2,3,6,7,10,12,24 h时间点取0.1 mL接收液,并在接收池中加入0.1 mL磷酸盐缓冲液。将取得的接收液(0.1 mL)离心(10000 r·min-1)5 min,取1 μL进样,测定含量[11-12]。

2.7观察小鼠皮肤中醇脂质体分布

2.7.1给药方法 制备含有1%罗丹明B的不同比例乙醇与丙二醇的醇脂质体,将醇脂质体涂抹于去毛的小鼠皮肤,12 h后,处死小鼠,剥离小鼠皮肤,放于载玻片,备用[13]。

2.7.2共聚焦激光扫描显微镜观测 共聚焦激光扫描显微镜对载玻片上的备用皮肤进行断层扫描。结果见图3。

2.8醇脂质体稳定性考察 分别将制备的醇脂质体置于冰箱(4 ℃)及室温下,每月测定其包封率,不间断测定3个月,考察醇脂质体的稳定性[14-16]。

3 结果

3.1处方筛选 确定处方中乙醇与丙二醇的最佳比例。预实验优化处方,当苦豆子总碱、醇相和磷脂分别为1%、45%和3%时,苦豆子总碱醇脂质体包封率相对最高,通过预实验发现乙醇与丙二醇的配比对粒径大小及包封率有很大的影响[17-18],对此,本实验考察乙醇与丙二醇不同比例时粒径大小及包封率的变化,结果见表1和表2。

表1 不同比例的乙醇与丙二醇制备苦豆子总碱醇脂质体

表2 不同比例乙醇与丙二醇的苦豆子总碱醇脂质体的粒径、PI、Zeta电位和包封率

3.2醇脂质体透射电镜图 透射电镜扫描苦豆子总碱醇脂质体(乙醇∶丙二醇=7∶3),见图1。

图1 醇脂质体(乙醇∶丙二醇=7∶3)透射电镜扫描图(×100000)

图1可见:醇脂质体(乙醇∶丙二醇=7∶3)均呈类球形或球形的囊泡。

表1、表2可见:当乙醇∶丙二醇=7∶3时,醇脂质体粒径最小(103.00±16.15)nm,包封率最高(89.13±0.42)%,Zeta电位最大(-50.00±6.00)mV。醇脂质体粒径越小,包封率越高,越易携带药物透皮吸收[19],而Zeta电位越大,表明电荷之间排斥越强,囊泡间凝聚力[20-23]降低,从而使醇脂质体更稳定,筛选出乙醇与丙二醇的最佳配比为7∶3。

3.3体外经皮渗透实验 本实验选用制备的苦豆子总碱醇脂质体进行体外经皮渗透实验,其24 h离体皮肤累积渗透曲线见图2。

从图2可知,24 h后苦豆子总碱二元醇脂质体(乙醇∶丙二醇=7∶3)累计渗透百分数最高,结果表明:二元醇脂质体(乙醇∶丙二醇=7∶3)中药物的渗透性均大于其他乙醇与丙二醇的配比。

3.4共聚焦激光扫描电镜观察醇脂质体在小鼠皮肤分布 对涂有罗丹明B的不同乙醇与丙二醇的醇脂质体小鼠皮肤进行断层扫描,不同比例的乙醇和丙二醇都可以携带药物进入皮肤,但图C较其他图而言皮肤深层的荧光强度最强,这表明醇脂质体(乙醇∶丙二醇=7∶3)可以增加药物的透皮量及皮内滞留量。结果见图3。

3.5苦豆子总碱醇脂质体稳定性考察 考察乙醇与丙二醇(7∶3)的醇脂质体在室温下3个月的稳定性,并观察外观,粒径大小和包封率的变化[24]。结果表明:在室温下依次于0、1、2、3月末取样,包封率分别为:89.13%、87.21%、85.06%;粒径分别为:103.00 nm、109.00 nm、111.00 nm,表明苦豆子总碱醇脂质体(乙醇∶丙二醇=7∶3)的外观、包封率及粒径未发生较大变化,表面醇脂质体的稳定性良好,无统计学差异。

图2 苦豆子总碱24小时离体皮肤累计渗透百分率

注:A.乙醇∶丙二醇10∶0;B.乙醇∶丙二醇9∶1;C.乙醇∶丙二醇7∶3;D.丙二醇5∶5;E.乙醇∶丙二醇3∶7;F.乙醇∶丙二醇1∶9;G.乙醇∶丙二醇0∶10

4 讨论

本实验为获得含3%的稳定的苦豆子总碱醇脂质体,减少包封后的渗漏,在乙醇脂质体中加入不同比例的丙二醇,考察其体外稳定性和透皮试验。最后选择乙醇与丙二醇的比例为7∶3,因为它具有最高的包封率(89.13±0.42)%、较小的粒径(103.00±16.15)nm、较小的PI(0.19±0.51)和最高的Zeta电位(-50.00±6.00)mV。囊泡越小,包被率越高,包被的药物越容易通过皮肤。苦豆子总碱醇脂质体具有缓释作用,这可能是因为苦豆子总碱在通过透析袋进入PBS之前要先穿透磷脂双分子层,使苦豆子总碱缓慢而持续地释放。为了研究醇脂质体在皮肤中的分布,目前有关醇脂质体的透皮机制研究主要采用荧光标记法,所用的磷脂荧光标记物为罗丹明B,其中荧光团通过化学键合与磷脂直接键合,通过观察罗丹明B在小鼠体内的渗透情况,可以推测二元醇脂质体对皮肤的渗透程度[25],在激光共聚焦显微镜下观察了小鼠皮肤外用罗丹明B醇脂质体24后皮肤各层荧光强度,从而对二元醇脂质体的透皮情况进行客观评价,实验表明,乙醇∶丙二醇7∶3时,罗丹明B透皮量和透皮深度最大。因此,考虑到含醇脂质体(乙醇∶丙二醇7∶3)的稳定性、较高的包封率、药物的透皮百分比和穿透深度,乙醇与丙二醇7∶3的比例为醇脂质体处方的最佳配比。