孙天驰，董诗慧，余佳琰，裘芳琼，秦路平，朱 波

（浙江中医药大学药学院，浙江 杭州 311402）

白术为菊科苍术属多年生草本植物白术（Atractylodes macrocephalaKoidz.）的干燥根茎，是常用大宗中药材，浙江著名道地药材“浙八味”之一，白术味甘、微辛，归脾、胃经，功效为健脾益气，燥湿利水，止汗，安胎[1]。现代药理研究表明，白术富含白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，苍术酮以及多糖类等多种活性成分，对抗肿瘤、抗炎、胃肠调节功能和降低胰岛素水平等方面具有积极作用[2]。白术在临床药理上有着广阔的开发前景与应用市场。

植物细胞悬浮培养是指将植物的细胞聚集体悬浮在液体培养基中进行体外培养的技术[3]，与栽培植物相比，植物细胞悬浮培养具有生产可控、无污染、产品质量稳定等优点[4]。目前，国内外学者对部分药用植物进行细胞培养，获得了重要的药用成分，如小蘖碱、丹参酮、喜树碱等[5]。

真菌诱导子是一类能诱导植物细胞产生次生代谢产物的活性物质，诱导子通过信号转导途径，引起相关基因表达发生变化，从而调节次级代谢产物合成途径中相关酶活性，诱导特定次级代谢产物积累[6]。张长平等[7]将尖孢镰刀菌胞壁成分的粗提物接入南方红豆杉中，诱导后第4 天，紫杉醇（Taxol）产量提高了5倍左右，达到67 mg/L。张顺仓等[8]对丹参接入诱导子后使其显著提高了酚酸类、丹参酮类物质含量。刘瑞等[9]在大豆悬浮培养细胞中接入青霉和黑曲霉诱导子后，其异黄酮含量发生了明显变化。KHOSROUSHAHI 等[10]通过诱导因子的组合分析发现，采用分阶段培养和混合诱导的方式可大幅度提高紫杉醇的含量。目前，未见对于内生真菌诱导子促进白术悬浮细胞生长和次生代谢产物积累的研究报道。鉴于此，拟通过构建白术悬浮细胞培养体系，以白术内生真菌为诱导子，研究其对白术悬浮细胞中活性成分积累的影响，为其扩大化生产提供参考。

1 材料和方法

1.1 白术无菌苗制备

白术种子采自浙江省绍兴市新昌县。将白术种子在黑暗条件下用无菌水浸泡12 h，剥去外种皮并包入灭菌纱布中，依次用75%乙醇浸泡1 min、用2.5%次氯酸钠浸泡3 min、用75%乙醇浸泡30 s，再用无菌水清洗4～5 次，至洗涤后的无菌水不再呈黄绿色。取出白术种子置于无菌滤纸上，吸干水分置于MS 培养基，在（25±1）℃、光照/黑暗为16 h/8 h、光照强度2 500 lx的无菌室中培养，获得白术无菌苗。

1.2 白术愈伤组织诱导

以茎尖为外植体，分别接种到激素配比为编号1[6-BA（6-苄氨基嘌呤）1.0 mg/L+NAA（1-萘乙酸）0.5 mg/L]、编号2 [6-KT（6-糠氨基嘌呤）1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L] 和编号3（6-BA 0.5 mg/L+6-KT 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L）的MS 固体培养基，每瓶接种3块外植体，在（25±1）℃、光照/黑暗为16 h/8 h、光照强度2 500 lx 下培养，接种41 d 后统计愈伤组织生长情况，计算诱导率（诱导出的愈伤数/接种的外植体数×100%）。

1.3 白术愈伤组织增殖培养基筛选

将诱导的愈伤组织均匀切分，称质量并分别放入A（6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L）、B（6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L）、C（6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L）、D（6-BA 0.5 mg/L）+NAA 0.1 mg/L）、E（6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L）、F（6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L）、G（6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L）、H（6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L）、I（6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L）共9 组增殖培养基中。每瓶接种3块愈伤组织，在（25±1）℃、光照/黑暗为16 h/8 h、光照强度2 500 lx 条件下增殖培养，继代21 d 后观察愈伤组织大小、疏松度，以“-、+、++、+++”表示褐化程度，并称质量，计算增殖系数（继代后成活愈伤鲜质量/初代愈伤鲜质量）、褐化率（褐化愈伤组织块数/愈伤组织总块数）。

1.4 白术悬浮细胞培养体系构建

以MS 液体培养基（不含琼脂）为基本培养基，加入前期筛选得到的白术愈伤增殖的最佳激素配方，将pH 值调至5.8，灭菌备用。选取6 次继代后疏松、白透的愈伤组织，无菌条件下将其用镊子和解剖刀剪碎，接入MS 液体培养基，于25 ℃、110 r/min条件下振荡暗培养。每3 d 取出适量悬浮细胞用孔径0.45 mm 筛网过滤，烘干后称取干质量，并测定培养液pH值，试验重复3次。

1.5 真菌诱导子制备

以浙江中医药大学植物内生菌课题组保存的白术内生真菌AM60、AM229、AM288、AM393、AM450、AM474、AM478、AM481、AM569 为菌种材料，将菌株接种于PDA 培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）活化5～7 d后，每个菌株打孔10个菌饼并接种到经120 ℃高压灭菌20 min 的PDB 培养基（马铃薯葡萄糖水培养基）中，以26 ℃、150 r/min摇床振荡培养至浓稠。取出培养物进行减压抽滤，得到菌丝提取物。用无菌水清洗菌丝提取物，在50 ℃烘干后用匀浆机粉碎，加入适量无菌水悬浮，用无菌过滤器过滤，配制成终质量浓度为2 mg/mL 的无菌诱导子溶液，待用。以不接种为空白对照（CK）。

1.6 悬浮细胞鲜质量与次生代谢产物含量测定

将无菌诱导子溶液添加至白术悬浮细胞体系，接种量为1 mg/mL，以26 ℃、150 r/min 振荡培养15 d后取出。用纯水将悬浮细胞充分清洗，去除残留培养液，减压抽滤，在滤纸上吸干表面水分，称质量。将悬浮细胞于60 ℃烘干至恒质量。用研钵碾成粉末，并称取样品各5 mg，加200 µL 甲醇，静置30 min，称质量。26 ℃恒温超声提取30 min，用甲醇补足差质量，过滤，取适量滤液过0.45 µm 微孔滤膜，待测。白术内酯Ⅰ、白术内脂Ⅲ与苍术酮含量测定参考丁逸雪等[11]的方法。

1.7 数据处理

使用Excel 2010、SPSS 25 软件进行统计分析和绘图，采用Duncan’s新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 激素对白术愈伤组织培养的影响

以MS 为基础培养基，比较6-BA、6-KT、NAA 3种激素及其不同质量浓度配比对白术愈伤组织培养的影响发现，MS + 6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L的配比优于其他组合，愈伤组织诱导率最高，达46.88%，详见表1。同时，以MS作为基础培养基，比较6-BA、NAA 2种激素在不同质量浓度组合下对愈伤组织增殖的影响（表2）发现，6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L处理效果最好，增殖系数达到4.51，与大多数处理存在显著差异且培育出的愈伤组织较疏松、颗粒状，其余处理在21 d 内的增殖效果不明显或褐化率较高。

表1 不同激素对白术愈伤组织诱导的影响Tab.1 Effect of different hormones on callus induction ofAtractylodes macrocephala

表2 不同激素对白术愈伤组织增殖的影响Tab.2 Effect of different hormones on the proliferation ofAtractylodes macrocephalacallus

2.2 白术悬浮细胞体系生长曲线

培养期内，白术悬浮细胞干质量表现为S 形曲线趋势，表明白术悬浮细胞生长呈现S 形特征（图1）。其中，0～6 d 为白术悬浮细胞缓慢生长期；6～21 d为白术悬浮细胞对数生长期；培养至24 d，形成稳定的悬浮细胞体系，白术悬浮细胞进入生长稳定期。

图1 白术悬浮细胞生长曲线Fig.1 Growth curve ofAtractylodes macrocephalasuspension cells

白术悬浮细胞培养液的初始pH 值为5.8，在刚接入悬浮细胞时pH 值呈下降趋势，在6～21 d 对数生长期间，pH 值保持在4.8～5.0。在24 d 悬浮细胞生长进入生长稳定期后，pH值缓慢上升后趋于稳定（图2）。

图2 白术悬浮细胞培养液pH值变化Fig.2 Change of pH value in culture medium ofAtractylodes macrocephalasuspension cells

2.3 不同诱导子对白术悬浮细胞生长的影响

真菌诱导子处理下白术悬浮细胞生长情况存在差异（表3）。与CK 相比，AM478诱导子对白术悬浮细胞生长促进作用最为显著，愈伤组织鲜质量达0.054 9 g，是CK 的2.19倍，整体培养液呈淡黄色，澄清，悬浮细胞黄褐色，生长势较好；其次是AM393诱导子处理，愈伤组织鲜质量达0.045 0 g，是CK 的1.79倍。

表3 不同诱导子处理组白术悬浮细胞鲜质量与有效成分含量比较Tab.3 Comparison of fresh weight and active ingredients inAtractylodes macrocephalasuspension cells after treated by different elicitors

2.4 不同诱导子对白术悬浮细胞次生代谢的影响

供试诱导子对白术悬浮细胞白术内酯Ⅰ含量积累没有显著性影响，但对白术内酯Ⅲ与苍术酮含量积累具有显著促进作用（表3）。与CK 相比，AM569 诱导子显著促进白术内酯Ⅲ积累，含量达0.023 5 mg/g。与CK 相比，AM60、AM229、AM450、AM474、AM478、AM481、AM569 对白术悬浮细胞苍术酮均有显著促进作用，其中AM474 促进效果最好，其苍术酮含量达0.673 8 mg/g，是CK 的1.62 倍；其次为AM478 与AM569，分别为CK 的1.53、1.45倍。综上，AM569 诱导子处理效果最好，可作为后续白术悬浮细胞生物转化的备选诱导子。

3 结论与讨论

白术是传统大宗药材，药用价值较高，临床应用广泛，具有改善溃疡性结肠炎[12]、免疫调节[13]、促进糖脂代谢[14]、抗肿瘤[15]等多种药理活性。白术的广泛应用对药材本身质量和有效成分产量有一定要求，如何提高白术有效成分积累成为关键点。本研究基于白术悬浮细胞培养体系，探讨不同真菌诱导子对白术悬浮细胞生长及其次生代谢产物积累的影响，为白术药效成分的获得及遗传转化体系建立提供参考依据。

生长素和细胞分裂素的种类及浓度是诱导愈伤组织的关键因素[16]。本研究结果表明，含6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L 的愈伤组织诱导培养基愈伤组织诱导率高。同时，选择细胞分裂素6-BA 和生长素NAA 进行不同质量浓度配比试验，根据愈伤组织状态、增殖系数、褐化状态和褐化率，6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L 处理增殖效果最佳，愈伤呈绿色、增殖系数最高为4.51 且无褐化现象。在该激素配比下，悬浮培养的白术细胞生长呈S 形曲线增长，0～6 d 为缓慢生长期，6～21 d 为对数生长期，21～30 d 为生长稳定期。在粗毛淫羊藿[17]、白及[18]、金荞麦[19]的研究中，由悬浮细胞干质量绘制而成的生长曲线均为S形曲线，与本研究结果一致。

培养液的pH 值是反映细胞生长的另一个重要指标。细胞缓慢生长期pH 值下降，对数生长期pH值稳定、波动小，生长稳定期pH 值上升。吴良等[20]关于剑麻悬浮细胞的研究中，pH值的变化与白术悬浮细胞pH 值的变化相似，在缓慢生长期和生长稳定期都处于较高值，对数生长期先下降后缓慢上升，处于较低值。丁兰等[21]关于半夏悬浮细胞的研究结果与本研究结果不同，半夏悬浮细胞是在细胞密度上升期pH 值升高，随着细胞衰老代谢缓慢，细胞密度下降期pH 值也相应下降。郭紫娟[22]关于白背三七悬浮细胞的研究中，pH值先短时间内下降然后缓慢上升，这可能是由于该悬浮细胞在培养后期分泌碱性次生代谢产物所致。

真菌诱导子可以对悬浮细胞培养物、植物无菌苗等生长产生显著影响，可以诱导培养物中积累次生代谢产物[23]。挥发油是白术主要药用成分，挥发油含量的高低在一定程度上影响白术的药用价值[24]。本研究结果表明，与CK 相比，AM478 真菌诱导子和AM393 真菌诱导子对悬浮细胞生长具有显著促进作用，AM569 真菌诱导子对白术内酯Ⅲ与苍术酮的含量积累具有显著促进作用。综合考量，AM569 真菌诱导子可作为白术悬浮细胞次生代谢产物生物合成的候选诱导子，具有较大的开发应用价值。