高倩 孙振琪 赵凯 赵梓晔 赵星月 赵明敏

摘要 采用芦苇、沙葱、洋葱提取物和蛇床子素对芜菁花叶病毒（tunip mosaic virus，TuMV）和马铃薯Y病毒（potato virus Y，PVY）进行预防作用、治疗作用、钝化效果的研究。结果表明，植物源提取物对TuMV有一定的抗病毒作用。在预防试验中，洋葱提取物的预防效果较好，接种的6株植物中仅有1株发病。蛇床子、沙葱提取物接种的6株植物中有3株发病。在治疗试验中，沙葱、洋葱、芦苇提取物和蛇床子素接种的6株植物，均有3株发病。4种植物源提取物对TuMV均有一定的钝化作用。其中蛇床子素的钝化作用最强，钝化TuMV后的植株发病率仅为16.67%，低于对照宁南霉素。4种植物源提取物对PVY的抑制作用不明显，发病株数均高于对照组宁南霉素处理的发病株数。该研究结果可为进一步研发植物源农药提供数据支持。

关键词 植物源提取物；PVY；TuMV；植物源农药

中图分类号 S 482.2+92  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2023）07-0154-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.07.036

Bioactive Natural Extracts from Plants against TuMV and PVY

GAO Qian， SUN Zhen-qi， ZHAO Kai et al

（ College of Horticulture and Plant Protection， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot， Inner Mongolia 010011）

Abstract In this experiment， the preventive， therapeutic and passivation effects of Phragmites australis， Allium mongolicum， onions extracts and osthol on tunip mosaic virus（TuMV） and potato virus Y（PVY） were investigated.The results showed that the plant-derived extracts had certain antiviral effect on TuMV. In the preventive test， the onion extract was more effective， with only one of the six plants inoculated developing the disease. Three of the six plants inoculated with the extracts of Allium mongolicum and osthol were diseased. In the therapeutic experiment， three of the six plants inoculated with Phragmites australis， Allium mongolicum， onions extracts and osthol were diseased. All four plant-derived extracts had a passivating effect on TuMV， with the strongest passivating effect of osthol， with only 16.67% plant incidence， which was lower than that of the control ningnanmycin. The inhibition of PVY by the four plant extracts was not significant and the number of diseased plants was higher than the control ningnanmycin.The results of the experimental study can provide data support for the further development of plant-derived pesticides.

Key words Plant-derived extracts；PVV；TuMV；Plant-derived pesticides

基金項目 内蒙古自然科学基金重大项目（2021ZD06）；内蒙古农业大学高层次人才引进科研启动项目（NDGCC2016-23）。

作者简介 高倩（1997—），女，陕西府谷人，硕士研究生，研究方向：植物抗病毒。

通信作者，教授，博士，从事植物病毒学研究。

收稿日期 2022-05-05

马铃薯是我国重要的粮食作物和经济作物之一。马铃薯病毒病是马铃薯最主要的病害。马铃薯Y病毒（potato virus Y，PVY）是马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）中最具代表性的一员［1］，其宿主范围包括34个属170余种植物，主要侵染茄科植物［2］。该病毒侵染植株后，症状表现通常有脉斑型、花叶型和褪绿斑点型，是危害作物生长最大的病害［3］。其主要通过汁液接触摩擦和嫁接传播，自然条件下借助蚜虫以非持久性的快速传毒方式传播，当PVY与其他病毒复合侵染时，还会造成更为严重的影响。PVY一旦侵染马铃薯就会造成巨大的经济和高达80%～90%产量损失［4］。

芜菁花叶病毒（tunip mosaic virus，TuMV）同样属于马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属，是危害大田蔬菜作物的第二大病毒，属于全球性的重要病害［5］。其主要通过蚜虫在田间传播，能够传播TuMV的蚜虫有90多种，使得TuMV发生普遍；还可以通过种子传播和汁液接触传播，对我国十字花科蔬菜的生产造成严重影响。TuMV具有广泛的寄主范围，侵染范围达150个属的300多个种［6］，被该病毒侵染后，前期症状多表现为花叶、皱缩、明脉，后期矮化、畸形等，造成作物产量降低、品质变差等问题［7］。

尽管在马铃薯生產上采用脱毒种薯、耐病抗病品种和化学药剂等方法［8］，能够在一定程度上减轻病毒病的危害，但植物生长中后期病毒的再次侵染仍会导致作物产量大幅度降低、品质不佳和种薯退化等问题。由于化学农药带来的问题日益严峻，越来越多的研究者开始关注植物源农药。植物源农药的低毒、低残留和不易引起抗药性的特点是化学农药无法比拟的［9］，对环境友好，更符合现代农业所追求的绿色环保理念，且植物源农药来源于大自然，种类多、分布广，具有很大的开发潜力和经济价值，所以筛选并开发高效低毒的植物源农药变得尤为迫切。

蛇床子素，主要是从伞形科和芸香科植物中提取的活性物质，蛇床子素具有异戊烯结构，可调节植物生长过程［10］，通过抑制真菌细胞壁上的几丁质沉积导致菌丝大量断裂的方式抑菌，还可抑制病原菌孢子产生、萌发、黏附、入侵［11］。研究发现蛇床子素对各种蔬菜白粉病、霜霉病、烟草花叶病毒［12］、马铃薯枯萎病［13-14］等有良好的防治效果［15］；蛇床子素的衍生物同样对胶孢炭疽菌、灰霉菌［16］及辣椒炭疽菌［17］显示出较强的抑制活性。

沙葱属于多年生鳞茎草本植物，主要分布在我国内蒙古自治区、宁夏和新疆等［18］。沙葱所含营养丰富，研究表明沙葱各部位的提取物在体外均有抗氧抗菌的作用［19］；沙葱的不同萃取物对放线菌、真菌有不用程度的抑制作用［20］；黄铜是沙葱提取物中含量最高的物质，试验表明也具有一定的体外抑制病毒的效果［21］。

洋葱属百合科葱属二年生草本植物［22］，含有多种抑菌成分，其中抑菌活性最强的是含硫化合物［23］。研究表明洋葱对结核分枝杆菌［24］、土壤细菌、真菌、放线菌［25］等的抑制效果都较明显；洋葱的浸提液和挥发物均具有广谱的抗病原真菌和卵菌活性［26］；洋葱汁对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌都会产生抑菌作用，且生洋葱汁的抑菌比熟洋葱的效果更显著［25］。

芦苇为禾本科多年生草本植物，主要通过根茎繁殖，可在世界所有温区生长［27］。研究表明芦苇提取物对霉菌、细菌都有一定的抑制性，且随着剂量的增加抗氧化的效果会明显增加［28］；丙酮提取的芦苇粗体物对小麦赤霉病菌、番茄灰霉病菌、苹果炭疽病菌的抑制作用都较为显著［29］。

研究表明，很多植物源提取物不仅具有增肥增产的作用，并在抑病抑菌方面发挥了重大作用，同时还可以提高植物免疫力、增强植株抗逆性和调节植物生长等［30］。笔者结合相关研究，利用可能具有抗病毒的活性植物源物质，测定芦苇、洋葱和沙葱植物源提取物和蛇床子素对TuMV和PVY的抑制作用，为防治病毒筛选出具有开发潜力的植物源提取物。

1 材料与方法

1.1 试验材料

植物源提取物：35％蛇床子素，90％芦苇提取物，1 g/mL沙葱浸提液，0.5 g/mL的洋葱浸提液。蛇床子素、芦苇提取物均购自西安金润生物科技有限公司。

供试病毒：TuMV、PVY均由内蒙古农业大学病毒实验室提供。

供试植株：本氏烟草，生长于恒温23 ℃、光照16 h和黑暗8 h的温室进行培养。当5～6片叶龄时，挑选大小一致的植物用于试验。

1.2 试验方法

1.2.1 植物源提取物的制备。

沙葱提取物：选取新鲜的沙葱组织，冲洗干净，准确称量200 g，切碎后加入200 mL无菌水浸泡，于摇床中150 r/min振荡48 h，用四层无菌纱布过滤掉植物组织，再用0.22 μm的细菌过滤器进行过滤，得到沙葱提取物。此过程需在无菌操作台完成，试验过程中所用仪器均进行灭菌处理。

洋葱提取物：新鲜洋葱去掉外皮，切丝后于50 ℃烘箱烘干并粉碎。置于具塞锥形瓶中，分别加入100 mL的丙酮、正丁醇、蒸馏水、乙醇、乙酸乙酯。将具塞锥形瓶放在50 ℃水浴锅中恒温水浴3 h（期间每20 min摇晃一次），离心，收集上清液。最后用70%乙醇定容至100 mL，分别放在棕色瓶中于冰箱中保存备用。

1.2.2 预防试验。

选取长势一致、生长健壮的3～5叶期本氏烟植株，植物源提取物蛇床子、芦苇、沙葱、洋葱为4个处理组，各处理先将植物源提取物分别均匀涂抹于本氏烟植株的第3、4片叶，静置10min后用清水喷洗，放于温室中黑暗处理24 h后，在处理叶片上分别摩擦接种TuMV、PVY病毒，10 min后用清水喷洗。植株在暗处覆膜培养24 h后转至正常条件下继续培养。同时设2个阳性对照和1个空白对照，其中阳性对照（CK1）先涂抹蒸馏水，24 h后再分别摩擦接种TuMV、PVY病毒；阳性对照（CK2）先涂抹宁南霉素，24 h后再分别摩擦接种TuMV、PVY病毒；空白对照（CK3）为不涂药和不接毒的正常植株。接种后约7 d观察植株症状，拍照并采样。

1.2.3 治疗试验。

选取长势一致、生长健壮的3～5叶期本氏烟植株，植物源提取物蛇床子、芦苇、沙葱、洋葱为4个处理组，首先，各处理分别摩擦接种TuMV、PVY病毒，静置10 min后用清水喷洗，放于温室并进行黑暗处理24 h后，将植物源提取物均匀涂抹于接种叶片，10 min后用清水喷洗。植株在暗处覆膜培养24 h后转至正常条件下继续培养。同时设2个阳性对照和1个空白对照，其中阳性对照（CK1）先分别摩擦接种TuMV、PVY病毒，24 h后再涂抹蒸馏水；阳性对照（CK2）先分别摩擦接种TuMV、PVY病毒，24 h后再涂抹宁南霉素；空白对照（CK3）为不接毒和不涂药的正常植株。接种后约7 d观察植株症状，拍照并采样。

1.2.4 钝化试验。

选取长势一致、生长健壮的3～5叶期本氏烟植株，植物源提取物蛇床子、芦苇、沙葱、洋葱为4个处理组，各处理分别与TuMV、PVY病毒粗提液等体积混合，钝化30 min后，分别摩擦接种本氏烟植株第三、四片叶，10 min后用清水喷洗。植株在暗处覆膜培养24 h后转至正常条件下继续培养。同时设阳性对照2个和空白对照1个，其中阳性对照（CK1）以蒸馏水与TuMV、PVY病毒粗提液等体积混合；阳性对照（CK2）以适宜浓度宁南霉素与病毒粗提液等体积混合；空白对照（CK3）为正常植株。接种后约7 d观察植株症状，拍照并采样。

1.2.5 Western blot。

将烟草叶片采集后，研磨成粉末，使用UREA缓冲液提取蛋白质，并在12％SDS/PAGE中进行电泳，然后转移至PVDF膜中。通过丽春红染色10 min检查转膜情况，通过蒸馏水洗涤，将膜完全脱色。将膜放在封闭溶液中封闭2 h。用TBS洗膜3次，每次10 min，然后一抗孵育，PVY-CP（1∶1 000）和GFP抗体（1∶5 000）在4 ℃过夜孵育。用TBS缓冲液洗涤3次，每次10 min后，在室温下将膜在二抗（山羊抗兔，1∶5 000）中孵育1 h。用TBS缓冲液洗涤3次，每次10 min，最后加入ECL显色液，在近红外双色激光和化学发光双功能成像系统上观察蛋白条带。

2 结果与分析

2.1 植物源提取物对TuMV的预防作用

在预防试验中，4种植物源提取物对TuMV表现出一定的预防效果。由图1可知，其中洋葱提取物的预防效果较好，接种的6株植物中仅有1株发病，发病率仅为16.67%，低于宁南霉素的发病率；蛇床子、沙葱提取物接种的6株植物中有3株发病，发病率为50%，与对照宁南霉素相同；芦苇对TuMV没有明显的预防效果，接种的6株植物中有4株发病，发病率为66.67%，高于宁南霉素的发病率。

2.2 植物源提取物对TuMV的治疗作用

在治疗试验中，4种植物源提取物对TuMV表现出一定的治疗效果。由图2可知，蛇床子、沙葱、洋葱、芦苇提取物接种的6株植物，均有3株发病，发病率为50%，与宁南霉素的发病率50%相同。

2.3 植物源提取物对TuMV的钝化作用

在钝化试验中，4种植物源提取物对TuMV表现出一定的钝化效果。由图3可知，蛇床子提取物对TuMV钝化效果较好，接种的6株植物中仅有1株发病，发病率为16.67%，低于宁南霉素的发病率；沙葱提取物对TuMV的钝化效果不理想，接种的6株植物中有4株发病，发病率为66.67%，高于宁南霉素的发病率；洋葱提取物对TuMV的钝化效果不理想，接种的6株植物中有5株发病，发病率为83.33%，高于宁南霉素的发病率；芦苇提取物对TuMV的钝化效果不理想，接种的6株植物中有3株发病，发病率为50%，与宁南霉素的发病率相同。为进一步验证蛇床子、沙葱、洋葱和蘆苇提取物对TuMV钝化后的病毒积累量的影响，将蛇床子、沙葱、洋葱和芦苇提取物处理后，将未发病的植株和对照处理组分别采样后提取其蛋白质，利用Western blot检测病毒含量，结果显示蛇床子提取物钝化TuMV后的植株体内检测不到病毒含量，沙葱、洋葱和芦苇提取物钝化TuMV后的植株体内还可以检测到病毒含量（图4），与对照组相比较病毒含量较低，说明蛇床子提取物可以起到钝化TuMV的作用。

2.4 植物源提取物对PVY的预防作用

在预防试验中，4种植物源提取物对PVY未表现出一定的预防效果。由图5可知，蛇床子、洋葱提取物对PVY没有预防效果，接种的6株植物均发病，发病率为100%；沙葱提取物对PVY同样没有预防效果，接种的6株植物有5株发病，发病率为83.33%；芦苇提取物对PVY的预防效果不明显，接种的6株植物有4株发病，发病率为66.67%，以上处理组的植株发病率均高于对照组宁南霉素的发病率。

2.5 植物源提取物对PVY的治疗作用

在治疗试验中，4种植物源提取物对PVY未表现出一定的治疗效果。由图6可知，蛇床子、沙葱、洋葱提取物接种的6株植物中有4株发病，发病率为66.67%；芦苇提取物接种的6株植物中有5株发病，发病率为83.33%，以上处理组的植株发病率均高于对照组宁南霉素的发病率。

2.6 植物源提取物对PVY的钝化作用

在钝化试验中，4种植物源提取物对PVY的钝化效果不明显。由图7可知，蛇床子、沙葱、洋葱提取物处理后的钝化效果，接种的6株植物中有3株发病，发病率为50%，高于宁南霉素的发病率；芦苇提取物的抑制效果不稳定，接种的6株植物中有2株发病，发病率为33.33%，与宁南霉素的发病率相同。

3 结论与讨论

PVY和TuMV由于寄主广泛、危害严重，是造成马铃薯、大白菜和油菜等作物大量减产和种质退化的主要原因。由于化学农药的分子结构单一、稳定性强、毒性大、使用后不易降解的缺点［31］，且会使有害生物产生抗药性并残留在作物上直接或间接地进入人体，对人类的生存发展和生态环境造成了严重威胁，所以具有环保无公害、成分天然有效、不易产生抗药性和高度选择性等特点的植物源农药已经成为当今防治植物病毒病的热门手段［32］。

植物源提取物抗病毒早在多年前便开始研究，其中一部分已被应用于生产实践中，我国植物资源丰富，为天然抗病毒的植物抑制剂开发提供了更多的选择。据研究PopW对烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）的防治效果十分显著，高达80%以上［33］；金钟柏提取物通过减少病毒外壳蛋白的表达量从而起到抑制西瓜花叶病毒的作用［34］；从紫草中提取的天然物质PZ1通过阻止核糖体与TMV-RNA结合来抑制病毒蛋白合成，从而达到抑制烟草花叶病毒的目的［35］；利用超声波提取鱼腥草、马齿苋、商陆三者的混合物质对番茄花叶病毒病也有较好的防治效果［36］；苋菜中提取的苋菜红素对烟草花叶病毒的抑制率高达90%以上［37］。

基于上述研究，该试验分别研究了沙葱、洋葱、芦苇提取物和蛇床子素对TuMV和PVY的抑制作用。结果发现洋葱提取物对TuMV的预防效果显著；蛇床子提取物对于TuMV的钝化效果显著，并通过Western blot试验得到验证；芦苇提取物钝化效果较低，沙葱和洋葱提取物的钝化效果则不明显；而4种植物源提取物对PVY侵染烟草的预防、治疗和钝化作用均不理想。这可能与试验中所用的4种植物粗体物中抗病毒活性成分较少有关，今后可以继续改进提取方式，通过进一步的分离提纯加大植物提取物中抗病毒成分的浓度，以期获得更为满意的抗病效果；植物源提取物对病毒病的防治有很好的效果，其中抗病毒机制可能与产生的小分子物质（生物碱、脂肪酸等）和大分子物质（多糖和蛋白类）有关［38］，对于4种植物源提取物抑制TuMV和PVY的活性成分和作用机制尚未彻底明确，之后还需继续深入研究确定其作用机理。此外，后续研究可根据试验结果继续进行大田试验，测试4种植物源提取物在大田中的实际防治效果。

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