陈燕 曹颖 刘恒星 刘东焕

摘要 ［目的］了解忍冬屬物种的亲缘关系及花粉可育性，为忍冬分类和杂交育种工作提供科学依据。［方法］采集4种忍冬属植物新鲜花粉，分别进行花粉形态的扫描电镜观测及不同温度处理下花粉离体萌发的活力检测，并进行数据分析。［结果］忍冬属花粉均为球形或近球形（1.10≤P/E≤1.15），中等或大花粉，3或4环状萌发孔沟，外壁纹饰为较为粗糙的刺突。聚类分析表明，新疆忍冬与刚毛忍冬的关系最近，金银花与贯月忍冬在欧式距离12处聚为一类。新疆忍冬的花粉活力最强，达到56.04%，刚毛忍冬在各种温度处理下花粉活力相对较低，仅为15.23%，2种藤本忍冬花粉活力居中，为40%～50%。新疆忍冬和刚毛忍冬的花粉在中温环境下萌发最好，贯月忍冬和金银花的花粉在高温环境中更易萌发。［结论］花粉形态的数量分类结果与现行忍冬属植物分类系统大致吻合，可以指导杂交育种工作、花粉活力强的物种可作为杂交授粉的父本。

关键词 忍冬属；花粉形态；花粉活力；亲缘关系；杂交

中图分类号 S 567.7+9  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2023）07-0116-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.07.028

Numerical Taxonomy of Pollen Grain Morphology and Comparsion of Pollen Grain Viability in Four Species of Lonicera Linn.

CHEN Yan1，2，   CAO Ying1，2，   LIU Heng-xing1，2 et al

（1.Beijing Botanical Garden/Beijing Floriculture Engineering Technology Research Centre， Beijing 100093; 2.Beijing Laborary of Urban and Rural Ecological Environment， Beijing 100083）

Abstract ［Objective］In order to understand the genetic relationships and pollen fertility of Lonicera， as well as to provide references for classification and cross breeding. ［Method］Fresh pollens of four species in Lonicera were collected respectively. The pollen morphology was observed by scanning electron microscopy （SEM） and pollen germination in vitro was detected under different temperature treatments， then data were analyzed. ［Result］The results showed that the pollen grains of all Lonicera were spheroidal shape（1.10≤P/E≤1.15）， medium or large size with tricolporate or tetracolporate， and extine ornamentation was scabrous echinate. L. tatarica and L. hispida had closest relationship， L. japonica and L. sempervirens were clustered together when Euclidean distance was 12. The highest pollen germination rate was found in L. tatarica （56.04%）， whereas the pollen of L. hispida had the lowest viability （15.23%）， the pollen germination rates of two climbing honeysuckles were on average 40%-50%. Pollens of L. tatarica and L. hispida had best germination rate under medium temperature treatment， while L. japonica and L. sempervirens had optimum pollen germination rates under high temperature treatment. ［Conclusion］The genetic relationships of Lonicera based on pollen morphology were roughly consistent with the current classification system of Lonicera， which can guide cross breeding of this genus. Species with high pollen viability can be served as pollen donors for cross breeding.

Key words Lonicera;Pollen morphology;Pollen viability;Genetic relationship;Cross breeding

基金项目 北京市科技计划课题项目“基于改善本地生态功能的植物引进、筛选、培育研究及示范”（D171100007117002）。

作者简介 陈燕（1981—），女，青海西宁人，正高级工程师，硕士，从事园林植物引种选育研究。通信作者，正高级工程师，硕士，从事园林植物栽培生理研究。

收稿日期 2022-08-08

忍冬属（Lonicera）植物隶属川续断目忍冬科，依据不同的分类观点，《中国植物志》和《Flora of China》分别记载全球有180种和143种，分布于北美洲、欧洲、亚洲和非洲北部的温带和亚热带地区，我国分别有98和57种，以西南部种类最多［1-2］。忍冬属以富含观赏植物和传统中药材而著称，具有重要的生态、观赏和经济价值［3-4］。

花粉是植物的雄性生殖器官，其形态主要受基因型调控，是研究植物分类和亲缘关系的重要依据之一［5-6］。对该属植物花粉形态研究多以药用金银花、食用蓝靛果或某一地区的植物为主［7-10］，而对该属不同种源地不同物种之间的花粉形态比较尚鲜见报道，对该属植物的分类体系也尚未完全达成一致［1-3，11-12］。掌握忍冬属物种间亲缘关系有利于开展杂交育种工作。

杂交育种是该属植物新品种培育方法之一［4］，父本花粉活力的高低直接影响着育种的成效［13］。花粉活力受遗传特性、环境因素、贮藏方法和贮藏时间等多方面的影响［14-15］，不同物种花粉活力及同一物种在不同环境条件下花粉活力是有差异的。花粉活力可以通过K-KI溶液、TTC染色以及花粉离体萌发率等多种方法测定，而最可靠的测定方法之一是花粉离体萌发率的测定，是衡量花粉萌发力的直接指标［16］。刘安成等［17］比较了不同培养基配比、不同培养温度及不同花粉采集时间对几种藤本忍冬花粉离体萌发率的影响；尉倩等［18］优选出郁香忍冬的新鲜花粉在30%蔗糖+100 mg/L硼酸的离体花粉培养液上于温度12 ℃环境中培养3 h，萌发率可达96.28%；郭红艳等［19］研究认为，2个金银花品种均在20%蔗糖+0.03%硼酸的培养基上萌发效果最好；刘会超等［20］研究认为，150 mg/L蔗糖、30 mg/L硼酸培养基有利于金银花花粉的萌发，其花粉低温贮藏（-80 ℃）优于冷藏（4 ℃、 -23 ℃），不宜常温贮藏；王丽瑛等［15］研究认为，鞑靼忍冬等3种忍冬花粉适合于低温0～4 ℃贮藏，而花粉萌发最适培养基为10％蔗糖+1％琼脂；欧洲甜樱桃花粉活力在30 ℃迅速下降［14］。

笔者运用扫描电镜对4种忍冬花粉形态特征进行观察比较和统计学分析，探讨物种之间的亲缘关系，旨在形成科学有效的杂交组合，通过不同温度处理下忍冬花粉离体萌发率的测定比较，筛选出育性好的父本花粉，以期为分类和杂交育种工作提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试材为2017—2019年在全国各地引种收集的4种忍冬属植物（表1）。栽种于北京植物园苗圃内，正常养护管理，正常开花结实。2021年4—6月，即不同植物各自自然初花期，分别采集其含苞待放的花蕾、取出花药、阴干后保存至小玻璃瓶中，在4 ℃冰箱低温贮藏，待测。

1.2 方法

1.2.1 花粉形态观測。

将干燥的新鲜花粉少量均匀地涂在粘有双面胶带的金属样品台上，用常规真空喷镀法喷金处理后，将样品置于Hitachi S-4800型扫描电镜下观察，选取完整饱满外形和大小有代表性的花粉粒，在清晰视野下观察花粉的形状、大小、萌发孔、表面纹理等特征，并摄像。

每种材料各随机选取摄像清晰的10粒花粉，保存图片用Image J软件分别测定花粉的极轴长（P）、赤道轴长（E）、边缘直立的刺突长度（L）、正面刺突基部直径（Dia）、刺突密度（D）、萌发孔长度和萌发孔宽度等定量数据以及表面纹饰和花粉类型等定性指标，其中用花粉粒表面中部每（15×15） μm2所分布的刺突数衡量花粉表面刺突的密度（D），定性指标则采用分解法进行编码（表2）。描述术语参照《孢粉学术语》［21］和《孢粉学手册》［22］。利用 SPSS 19软件将数据方差分析后，对测定指标进行主成分分析，然后对各主成分采用类平均法和欧氏距离进行系统聚类分析，绘制聚类分析图。

1.2.2 花粉活力测定。

对采集的新鲜花粉采用悬滴离体培养法测定花粉活力，在盖玻片上滴1滴成分为20%蔗糖+0.01%硼酸+0.01%钙的花粉培养液［17，19］，均匀地将花粉用解剖针挑落在液滴上，然后将盖玻片反转，置于预先准备好的表面潮湿的凹穴载玻片上，分别在8 ℃12 h/15 ℃12 h、15 ℃12 h/25 ℃12 h、25 ℃12 h/35 ℃12 h的气候箱内培养24 h，之后在显微镜下观测花粉管生长情况，以花粉管长度大于花粉粒直径作为萌发标准，3次重复，每个重复3个视野，计算其平均萌发率。

萌发率（%）=视野中萌发的花粉数（粒）/视野中总花粉数（粒）×100%，以萌发率作为花粉活力的指标。

2 结果与分析

2.1 花粉形态比较

2.1.1 花粉大小与形状。

从图1、表3可以看出，供试样本赤道面观均为圆球形或近球形（1.10≤P/E≤1.15），极面观为三裂或四裂圆形。新疆忍冬和刚毛忍冬为中等花粉（25～50 μm），金银花和贯月忍冬2种藤本类忍冬为大花粉（50～100 μm）。

2.1.2 花粉萌发孔特点。

所有样本均为环状萌发孔沟类型，且沟普遍较短，除了刚毛忍冬孔沟明显有较深的孔洞外，其余从表面看内孔不显著。刚毛忍冬为N3P4C5型，其余3种为N3P4C3型花粉（表3）。

2.1.3 花粉表面纹饰。

该属花粉外壁纹饰粗糙状，多为刺突状，其中新疆忍冬和刚毛忍冬外壁纹饰为刺突状及具有微小、不规则条纹的覆盖层表面，2种藤本忍冬为刺突状与具有微小、浅薄的穿孔状覆盖层组合（表3）。

2.1.4 数据分析。

主成分分析是一种降维或将多个指标转化为少数几个综合指标的一种多元统计分析方法，通过软件分析得到特征值和特征向量（表4）。由表4可知，第1主成分贡献率为55.276 0%，第2主成分贡献率为29.704 8%，第3主成分贡献率为15.019 2%，3个主成分累计贡献率达到100%，可反映原始数据信息，作为数据有效成分，进一步得到4个物种的成分得分（表5）。

采用表5中主成分得分代替原始指标对样本进行聚类分析［23］，结果见图2。聚类分析将样本分为3组，第1组为新疆忍冬和刚毛忍冬，共有特征是花粉普遍较小，表面纹饰为刺突状，且其覆盖层具有微小的不规则条纹；第2组为忍冬组金银花，特征是大花粉，萌发沟短，表面纹饰为刺突状和具有微小、浅薄的穿孔状覆盖层组合；第3组为花粉较大、萌发沟较长的贯月忍冬。这大致与现行忍冬属植物分类系统吻合［1-3］，新疆忍冬、刚毛忍冬为灌木属忍冬亚属，金银花、贯月忍冬属为藤本类。

2.2 不同温度条件下花粉活力测定

从表6、图3可以看出，在8 ℃/15 ℃的低温变温条件下，除了刚毛忍冬花粉不能萌发外，其余物种花粉萌发率普遍偏低，不超过30%；中、高温培养使几种忍冬花粉均有不同程度的萌发，其中新疆忍冬萌发率最高，分别为56.04%和53.03%，其次依次为贯月忍冬和金银花，也均在20%以上，刚毛忍冬花粉在该温度范围内较低温培养有一定程度的萌发，但萌发率较低，为15%左右。

由此可知，8 ℃/15 ℃低温培养不利于4种忍冬花粉的萌发，随着温度的升高其花粉萌发力逐渐升高。新疆忍冬和贯月忍冬花粉在各种温度环境下均有不同程度的萌发，但中、高温环境更有利于其花粉的萌发，低温状态花粉不活跃；金银花在各种温度下均有较好的萌发效果，其中在高温培养下花粉萌发效果最好；刚毛忍冬在低温环境下花粉不能萌发，在中、高温环境下花粉萌发力也不高，因此不适合作为杂交父本。

3 结论与讨论

3.1 花粉形态确定分类关系与演化趋势推导

花粉形态很少受到环境因素的影响，在进化过程中具有保守性，可用于物种亲缘关系和分类研究［24-25］。忍冬属花粉均为球形或近球形，中等或大花粉，3或4环状萌发孔沟，外壁纹饰为相对较为粗糙的刺突。通过花粉形态的聚类分析表明，空枝组的新疆忍冬与大苞组的刚毛忍冬关系较近，金银花与贯月忍冬在欧式距离12处聚为一类。聚类结果总体上支持现行形态学和分子分类结果，但也出现了一些不一致的情况，如隶属忍冬亚属（Subgen.Chamaecerasus）的金银花因花粉大小与该亚属的新疆忍冬和刚毛忍冬差异过大，而其遗传距离较与轮花亚属（Subgen.Lonicera）的贯月忍冬更近一些，因此不能完全依据花粉形态确定植物的分类地位。

目前普遍认为，花粉是从大向小、从外表光滑到粗糙的顺序演化，即相对原始的被子植物花粉体积相对较大，外壁相对光滑［23］。该研究供试样本中贯月忍冬个体最大、外壁刺突相对平滑柔和，而隶属中等大小花粉的新疆忍冬和刚毛忍冬外壁粗糙，为刺突状与覆盖层具条纹状凸起的结合，忍冬亚属物种比贯月忍冬进化，这与汤彦承等［11］所述的“轮花亚属保留较多的原始性状，显示其古老性”相符合。

3.2 花粉形态与花形态比较

花粉大的植物，其花朵也相对较大，如藤本类忍冬均为大花粉，而其花朵也相对较大，有研究表明花粉大小与花柱大小有一定的相关性［26］，花柱与花朵也存在一定比例关系，花朵大小、花粉数量与花粉大小的关系需做进一步研究。另外，从花粉形态聚类分析可以看出，遗传距离较近的物种花期也较接近，如新疆忍冬与刚毛忍冬均为4月左右开花，而与其关系较远的种类开花时间也相继不同，植物物候期和亲缘关系是否存在相关性、花期不同是否存在生殖隔离等也需要进一步探讨。

3.3 不同温度处理下的花粉活力

植物花粉活力是基因和环境互作的结果［14］。在最适温度环境下，花粉萌发力强的物种，适应性强，结实率较高，繁衍后代的能力较强，而花粉萌发力低会阻碍物种传粉受精、坐果结种，从而影响其繁衍生息，甚至会导致物种濒危灭绝［27］。该研究中，新疆忍冬的花粉活力最强，在自然界的结实率也最高，植物扩散能力强，而刚毛忍冬在各种温度处理下花粉活力相对较低，适应环境的能力相对较弱，2种藤本忍冬花粉活力居中。

测试植物产地不同，花期物候也各异，因此花发育所需的环境条件也各不相同。該研究中原产新疆的新疆忍冬以及原产高海拔的刚毛忍冬花期靠前，气温相对较低，花粉在中温环境下萌发最好，而原产北美和河北并广布全国多地的贯月忍冬和金银花，花期相对较晚，温度逐渐升高，其花粉在高温环境中更易萌发。这与Hedhly等［14］研究得出的“植物花粉萌发的最佳温度反映了该植物自然花期的主要温度变化”一致，有研究表明，喜温暖植物的花粉萌发温度比喜冷凉的植物所需温度高，同时花粉萌发对温度的不同要求，在一定程度上也能反映该植物的耐热性［14］，说明金银花和贯月忍冬比其他2种灌木忍冬更加耐热。

3.4 花粉形态和活力测试结果对杂交育种的指导

将上述测试结果运用于杂交育种实践中，发现除了空枝组内部、忍冬组内部杂交可以结实，大苞组的刚毛忍冬与新疆忍冬、贯月忍冬与忍冬亚属忍冬组的金银花杂交均可获得杂种，但需要注意正反交，如贯月忍冬为母本、金银花为父本的组合可以结实，反之则不能结实，这与父母本大小孢子发育情况相关，还需做进一步研究。

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