张 城，杨 倩，姚 俊，曹 新

南京医科大学医学遗传学系，江苏 南京 211166

氧化固醇结合蛋白样蛋白2（oxysterol binding protein-like 2，OSBPL2）与氧化固醇结合蛋白（oxysterol binding protein，OSBP）同源，属于OSBP 相关蛋白（OSBP-related protein，ORP）家族成员，作为一种重要的固醇感受器，参与了脂质代谢、囊泡运输、信号转导和细胞骨架调控等生物学过程［1］。本课题组在前期研究中发现OSBPL2是常染色体显性遗传性非综合征型耳聋（DFNA）的致病基因之一［2］，OSBPL2敲除的巴马小型猪以及小鼠模型均表现为进行性听力损失，并伴随有毛细胞静纤毛的形态异常［3-4］。毛细胞静纤毛是主要由肌动蛋白构成的特化细胞器，静纤毛以及肌动蛋白骨架功能正常是听觉发生的必要条件。OSBPL2在耳蜗内毛细胞和外毛细胞的静纤毛中均有定位［5］，提示OSBPL2在听觉细胞的肌动蛋白骨架调控中可能发挥重要作用。有研究发现，OSBPL2缺失会导致HuH7细胞中黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）的磷酸化水平降低，并进一步抑制细胞肌动蛋白骨架重塑、伪足与细胞极性形成、细胞迁移、细胞黏附和细胞周期［6］。此外，OSBPL2也可以作为肌动蛋白细胞骨架的脂质感受器，通过介导RhoA信号通路影响肝脏细胞的迁移、黏附和增殖［7］。RhoA 是Rho GTPase 家族重要成员之一，参与了多种以肌动蛋白为基础的生物学过程，特别在肌动蛋白细胞骨架的重排中发挥重要调控作用［8］。但在内耳组织和听觉细胞中，OSBPL2是否存在同样的调控机制仍需进一步研究。本研究将从体内外水平研究OSBPL2参与听觉细胞肌动蛋白细胞骨架调控的机制，为进一步探索OSBPL2 生物学功能及其突变致聋机制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠耳蜗感觉上皮永生化细胞株HEI-OC1 细胞及其OSBPL2 敲除（Osbpl2-KO）细胞株由本实验室构建和保存［9］，Osbpl2-KO 小鼠及其同窝野生型（Osbpl2-WT）小鼠由南京医科大学动物中心净化并配繁［4］。实验经过南京医科大学动物福利伦理委员会同意（伦理编号：IACUC-1801003-1）。

实验所用抗体：纤维肌动蛋白（fibros actin，Factin）抗体（MA1-80729，上海赛默飞）、OSBPL2抗体（14751-1-AP，武汉Proteintech 公司）、GAPDH（5174S，CST，美国）、RhoA（A19106，武汉爱博泰克）、Rho 激酶2（Rho-associated coiled-coil-containing proteing kinase2，ROCK2）（A5698，武汉爱博泰克）、肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白1（actin depolymeriza factor/cofilin 1，ADF/CFL-1）抗体（5175，CST公司，美国）、Lim激酶1（LIM domain kinase 1，LIMK1）抗体（A16664，武汉爱博泰克），Phospho-LIMK1抗体（APO387，武汉爱博泰克），山羊抗鼠、抗兔IgG二抗（SA00001-1、SA00001-2，武汉Proteintech 公司）、荧光标记山羊抗鼠、抗兔二抗（1741782、1748346，上海赛默飞）。

其他试剂：Western 及IP 细胞裂解液（P0013，南京碧云天）、RIPA 裂解液（P0013B，南京碧云天）、SYBRRGreen Master Mix（Q131，南京诺唯赞）、TGX Stain-FreeTMFastCastTMAcrylamide Kit、基因扩增引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

在DMEM 培养基中加入10%胎牛血清制成完全培养基。将HEI-OC1 细胞培养在DMEM 完全培养基中，置于10%CO2饱和湿度的33 ℃细胞培养箱中培养，当细胞密度达到80%～90%，用胰酶消化、传代并冻存，以备后续实验使用。

1.2.2 耳蜗组织采集

取Osbpl2-KO 小鼠和Osbpl2-WT 对照小鼠，麻醉后用生理盐水进行心脏灌注。待灌注出的生理盐水澄清后，给小鼠断头，取出耳蜗，体视显微镜下用镊子去除多余肌肉组织并在蜗顶打洞后多聚甲醛固定过夜，第2 天将耳蜗取出用PBS 清洗3 遍后，置于EDTA慢脱钙液中，脱钙7～10 d，脱钙过程中可用镊子夹一下耳蜗来衡量脱钙状态，镊子夹起富有弹性则表示脱钙完成。

1.2.3 扫描电镜

将完成脱钙的小鼠耳蜗置于体式显微镜下，采用显微镊与显微剪分离基底膜，浸入5%戊二醛固定过夜；将固定后的基底膜依次浸入50%、70%、90%、100%乙醇中脱水各5 min，冻干后喷金；扫描电镜下观察毛细胞静纤毛的形态与排列，并在不同观察视野中选取17～18 个细胞，Image J 统计静纤毛长度和宽度。

1.2.4 细胞爬片免疫荧光染色

待细胞密度为60%～80%时，吸弃原培养基，在培养板中将已爬好细胞的玻片用4 ℃预冷PBS洗涤3 遍；4%多聚甲醛固定爬片30 min，PBS 浸洗玻片3次，每次3 min；0.3%Triton X 室温穿膜30 min，山羊血清封闭30 min；加稀释后的一抗4 ℃孵育过夜，PBS洗涤3遍，每遍5 min，加稀释后的二抗室温避光孵育1 h，PBS洗涤3遍后，DAPI室温孵育10 min，封片，荧光显微镜拍片，在观察视野中选取8～10 个细胞，Image J分析F-actin荧光强度以及ADF/CFL-1的表达定位。

1.2.5 细胞划痕实验

用直尺在6孔板底部画间隔1 cm的直线。将消化下来的细胞重悬移入6孔板，每孔约5×105个细胞，待细胞生长融合成单层状态后，用灭菌的200 μL枪头垂直于6孔板底部横线划线，PBS洗涤3遍使得划痕边缘清晰，随后加入无血清培养基。分别在0、12、24 h用倒置荧光显微镜拍照保存，使用Image J软件进行分析。

1.2.6 Western blot实验

取处在对数生长期的细胞株培养瓶，弃去培养液后，PBS 清洗3 遍。加入含蛋白酶抑制剂的RIPA强裂解液于冰上裂解15 min；将细胞裂解液转移至1.5 mL 离心管，冰浴中超声破碎处理3 次，每次5 s；12 000 r/min离心10 min（4 ℃），收集上清，采用BCA法测定各样品蛋白浓度。取等量蛋白，采用12%SDS-PAGE 电泳分离蛋白，并转移至PVDF 膜上。5%脱脂奶粉溶液封闭2 h，PBS洗涤后加入一抗4 ℃孵育过夜，加入相对应二抗室温孵育2 h，PBS 洗涤后采用增强化学发光显色法显色，采用凝胶成像系统观察拍照。

1.2.7 实时定量PCR

使用TRIzol 提取HEI-OC1 细胞总RNA，测定RNA 浓度后，取1 μg 总RNA 反转录成cDNA，然后进行实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT -PCR）检测。采用20 μL 扩增体系：SYBR®Green Master Mix 10 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。扩增程序如下：预变性95 ℃5 min；变性95 ℃10 s，退火/延伸60 ℃30 s，共40 个循环，目标基因CT值使用GAPDH 基因CT值校正。引物序列见表1。

表1 实时定量PCR引物Table 1 Primers for qRT-RCR

1.3 统计学方法

每组实验至少重复3 次，使用GraphPad Prism软件进行相关统计学分析。实验数据采用均数±标准差（）表示，两独立样本采用t检验进行组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Osbpl2-KO对HEI-OC1细胞肌动蛋白骨架形态和功能的影响

采用Phalloidin 对细胞F-actin 细胞骨架进行特异性标记。在Osbpl2-WT HEI-OC1 细胞中，细胞周围微刺突和丝状伪足丰富；分布于细胞周边的F-actin 外周致密束线条连续清晰，界限分明；由非极性单行排列的肌动蛋白丝组成的应力纤维以及核区周围的核骨架线条清晰，分布均匀，轮廓完整，在细胞中平行排列或者纵横交错形成网状结构。而在Osbpl2-KO HEI-OC1 细胞中，细胞外周微刺突和丝状伪足明显减少；F-actin 外周较为致密，但轮廓并不连续完整；核骨架以及应力纤维分布明显减少（图1A）。对细胞F-actin骨架的免疫荧光检测表明，Osbpl2-KO HEI-OC1细胞的F-actin骨架荧光强度明显变弱。细胞划痕实验结果表明，Osbpl2-KO HEIOC1 细胞迁移能力相比Osbpl2-WT 细胞明显减弱（图1B）。以上结果表明，Osbpl2-KO 显著影响了HEI-OC1 细胞的F-actin 细胞骨架形态、分布和完整性。

图1 Osbpl2-WT/KO HEI-OC1细胞肌动蛋白骨架形态功能分析Figure 1 Morphological and functional analysis of actin cytoskeleton in Osbpl2-WT/KO HEI-OC1 cells

2.2 Osbpl2-KO 抑制了HEI-OC1 细胞中RhoA/ROCK2信号通路

基于OSBPL2对HEI-OC1细胞F-actin细胞骨架结构和功能的影响，OSBPL2 可能通过介导RhoA/ROCK2 信号通路在听觉细胞肌动蛋白细胞骨架的结构和功能维持中发挥重要作用。qRT-PCR 和Western blot 检测结果表明，在Osbpl2-KO HEI-OC1细胞中，RhoA、ROCK2和LIMK1的转录和蛋白表达水平均呈现不同程度的下调（图2），而LIMK1 作为Rho/ROCK 信号通路重要的下游分子，其磷酸化修饰程度影响肌动蛋白细胞骨架的解聚和聚合。以上结果表明，OSBPL2 通过介导HEI-OC1 细胞中RhoA/ROCK2 信号通路来调控肌动蛋白细胞骨架，Osbpl2-KO 抑制了HEI-OC1 细胞中RhoA/ROCK2 信号通路的活性，导致下游LIMK1 磷酸化水平降低，使得肌动蛋白细胞骨架的稳定性减弱，从而导致肌动蛋白细胞骨架的功能缺陷。

图2 OSBPL2缺陷导致HEI-OC1细胞中RhoA/ROCK2信号通路被抑制Figure 2 OSBPL2 deficiency led to the inhibition of RhoA/ROCK2 signaling pathway in HEI-OC1 cells

2.3 OSBPL2对HEI-OC1细胞中ADF/CFL-1定位和表达的影响

ADF和CFL-1是肌动蛋白结合蛋白家族成员中作用于解聚微丝的蛋白群，同时也是LIMK1下游磷酸化的靶分子。ADF/CFL-1一般定位于细胞富含肌动蛋白微丝的部位，可切断微丝并与肌动蛋白单体结合，在调控微丝聚合与解聚的动态过程中发挥重要作用。对Osbpl2-WT/KO HEI-OC1 细胞的免疫荧光染色显示，ADF/CFL-1 定位于Osbpl2-WT HEIOC1 细胞外周的微刺突，丝状伪足以及应力纤维和核骨架肌动蛋白丝的末端。而在Osbpl2-KO HEIOC1 细胞中，定位有ADF/CFL-1 的F-actin 末端的数量显著减少（图3A、B）。此外，Osbpl2-KO HEI-OC1细胞中，ADF/CFL-1 的表达水平显著下降（图3C、D）。这些结果表明Osbpl2-KO抑制了HEI-OC1细胞中RhoA/ROCK2 信号通路的活性，且影响其下游效应蛋白ADF/CFL-1在F-actin 末端的定位，导致细胞肌动蛋白细胞骨架解聚失衡，从而影响了细胞肌动蛋白细胞骨架形态和功能。

图3 ADF/CFL-1在HEI-OC1细胞中的定位和表达Figure 3 Expression and localization of ADF/CFL-1 in HEI-OC1 cells

2.4 Osbpl2-KO对小鼠耳蜗毛细胞静纤毛形态的影响及其分子机制的验证

静纤毛是耳蜗毛细胞最先感受声波刺激的部位，其形态维持和生理功能的行使是听觉发生的必要条件。为此，进一步对OSBPL2-RhoA/ROCK2-ADF/CFL1 的分子机制进行了在体水平的验证，并探索了Osbpl2-KO对小鼠耳蜗毛细胞静毛形态的影响。Osbpl2-KO 小鼠耳蜗中，RhoA、ROCK2 和ADF/CFL1 均显示下调，这一结果与Osbpl2-KO HEI-OC1细胞中相应效应因子的变化趋势一致（图4A）。扫描电镜观察结果显示，与Osbpl2-WT 小鼠相比，Osbpl2-KO 小鼠耳蜗内毛细胞静纤毛排列较为紊乱，静纤毛的长度较短较细（图4B）。结果表明，OSBPL2 通过RhoA/ROCK2 信号通路介导了毛细胞肌动蛋白骨架的调控，并对耳蜗毛细胞静纤毛微丝骨架的形态维持和功能具有重要影响。

图4 OSBPL2介导RhoA/ROCK2信号通路影响小鼠耳蜗内毛细胞静纤毛形态Figure 4 OSBPL2 affected stereociliary morphology on mouse cochlear inner hair cells via the mediation of RhoA/ROCK2 signaling pathway

3 讨论

本课题组在前期研究中定位和克隆了一个新的遗传性耳聋致病基因OSBPL2［2］。在后续研究中，采用CRISPR/Cas9 技术构建了Osbpl2-KO 巴马小型猪模型和小鼠模型，成功模拟了人OSBPL2 的临床表型。此外，还在巴马小型猪模型上观察到耳蜗毛细胞以及静纤毛的形态异常，包括毛细胞缺失，静纤毛缺失、倒伏和排列紊乱等［3］。在Osbpl2-KO小鼠中也观察到异常的耳蜗发育并伴随有纤毛缺陷［4］。以上研究结果提示，OSBPL2突变导致的听力损失可能与耳蜗毛细胞肌动蛋白骨架形态和功能异常有关。

OSBP/ORP 家族成员在脂质代谢、囊泡运输和信号转导等方面发挥着重要作用［10-11］：OSBP/ORP羧基端共有含OSBP 指纹基序“EQVSHHPP”的ORD结构域（OSBP-related ligand-binding domain），在固醇结合中发挥重要作用；OSBP/ORP 和囊泡相关膜蛋白（vesicle associated membrane protein，VAP）相互作用介导胞内的膜接触位点进行物质交换和信息交流，从而维持细胞脂质的动态平衡［12］；OSBP/ORP家族成员还参与了细胞骨架的调控过程，如ORP3可以调节R-Ras 活性，进而调控F-actin 的组装［13］，ORP4 可以调控波形蛋白（vimentin）介导微丝组装过程［14］。OSBPL2（即ORP2）是OSBP/ORP 家族中唯一被发现与遗传性耳聋相关的基因，对其功能的研究最初集中在脂质代谢和固醇转运方面。近年来有研究发现OSBPL2可作为特定信号通路的效应因子行使其特有的生物学功能［15］。在HuH7 细胞中，OSBPL2 是AKT 信号通路的关键调控因子，同时也与多个Rho GTPase 信号通路效应因子如DIAPH1、MLC12、SEPT9 等存在相互作用，从而影响细胞肌动蛋白骨架重塑、伪足和细胞极性形成、细胞迁移、细胞黏附和细胞周期［7］。在Osbpl2-KO HEI-OC1 细胞中还发现了细胞黏附异常现象，且FAK 信号通路受到了抑制，而FAK 正位于Rho GTPase 信号通路的上游［9］。以上研究表明OSBPL2在听觉细胞肌动蛋白细胞骨架的调节中可能发挥着重要作用，并且可能是通过Rho GTPase信号通路来实现的。

Rho GTPase 家族成员参与了多种以肌动蛋白为基础的生物学过程［16］，包括细胞骨架重排，细胞生长、分化、黏附、迁移等。RhoA 是Rho GTPase 家族重要成员之一，在细胞微环境以及各种生长因子的作用下，以GTP结合的活性形式与GDP结合的非活性形式发挥其分子开关的调控作用。RhoA 的下游主要效应物Rho激酶是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，有ROCK1和ROCK2两种亚型，在细胞骨架重组、细胞迁移和应力纤维形成等发面具有重要的调控作用［17］。当RhoA 的活性形式与ROCK 结合后，ROCK进入激活状态，调控LIM 基序的LIMK 的磷酸化［18］。LIMK 又能磷酸化F-actin 并使其解聚活性失活，从而导致肌动蛋白丝的稳定［19］。RhoA/ROCK 信号通路及其效应因子在听力的发育和形成中也发挥着重要作用［20］。有研究表明ROCK2 是小鼠耳蜗内表达的主要亚型，噪音暴露可引起耳蜗中ROCK2的表达下调，引起耳蜗毛细胞肌动蛋白解聚，从而导致听力下降［21］。此外，ADF/CFL-1 作为LIMK1 下游磷酸化的靶分子，定位于耳蜗毛细胞静纤毛的顶端，参与调控毛细胞细胞骨架中肌动蛋白的解聚和聚合。其定位、表达和磷酸化水平的异常会影响肌动蛋白骨架的重塑和机械信号的传导，导致听觉器官发育异常和听力障碍［22］。本研究表明，在Osbpl2-KO 小鼠耳蜗和HEI-OC1细胞中均发现了肌动蛋白骨架形态异常，RhoA/ROCK2 信号通路的活性均受到抑制，下游LIMK1表达水平和磷酸化水平显著降低，并且导致LIMK1下游效应蛋白ADF/CFL-1表达水平明显下降，其在细胞微丝骨架中F-actin末端的定位明显减少。