赵曾强， 张国丽， 马盼盼， 李有忠， 王志军， 谢宗铭*， 孙国清，2*

（1.新疆农垦科学院生物技术研究所，作物种质创新与基因资源利用兵团重点实验室，新疆 石河子 832000；2.中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）

类受体胞质激酶（receptor-like cytoplasmic kinase，RLCK）是只含胞内激酶域的蛋白激酶，在拟南芥中有147个成员[1]，水稻中有379个成员[2]。研究表明，一些RLCK作为模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）复合体的核心组分[3-4]，可以激活PRR，并与各种早期信号事件关联[5-6]，参与植物免疫响应、信号传导及防御过程[7]。

在拟南芥中，AtRLCK-VII亚家族有47个成员，利用基因敲除技术敲除在模式触发免疫中扮演关键角色的基因并构建突变体，分别命名为RLCK VII-1～RLCK VII-9，结果表明，突变体RLCK VII-5、RLCK VII-7和RLCK VII-8在不同的PRR模式测定中均能影响活性氧 （reactive oxygen species，ROS）的产生，表明其成员广泛地参与多个PRR信号传递，而RLCK VII-4在几丁质诱导的ROS产生过程中存在特异性缺陷，表明RCLK VII-4特异性介导PRR信号转导，且RLCK VII-4参与几丁质诱导丝裂原活化蛋白激酶 （mitogenactivated protein kinase，MAPK）的激活[8]。以上结果表明，RLCK-VII家族成员参与PRR与MAPK激活的免疫响应，在植物抗病过程中起重要作用[9-10]。 RLCK-VII成 员 BIK1（botrytis-induced kinase 1，BIK1）是研究最深入的成员，在静息状态下，BIK1与FLS2（flagellin sensing 2）蛋白结合，也可能与BAK1结合，在flg22被激发后，BAK1（brassinosteroid insensitive 1-associated kinase 1）与FLS2结合并磷酸化BIK1；反过来，BIK1从PRR复合体解离之前磷酸化BAK1和FLS2，从而激活下游信号分子，BIK1和PBS1激酶(PBL)蛋白参与了由elf18、AtPep1和几丁质触发的免疫反应，这是早期不同PRR介导通路的聚合点[11-14]。水稻中，BSR1（RLCK VII）基因参与几丁质诱导的免疫应答，过表达BSR1基因增强了过氧化氢(H2O2)的产生，活性氧的积累增强了寄主植物对亲和病原菌的抗性，参与肽聚糖和脂多糖引起的免疫反应，提高了植物对真菌和细菌病原菌的抵抗力[15]。木薯中，MeRLCK-VII 家族MeBIK基因通常情况下表达量较低，受鞭毛蛋白flg22刺激后表达量显著提高，构建MeBIK1基因双元荧光素酶报告系统，利用拟南芥atbik1突变体开展遗传互补试验表明，MeBIKl基因能恢复拟南芥AtBIK1基因突变减弱的PTI反应，且转基因植株对黄单胞杆菌（XamHN04）抗性提高，对PstDC3000敏感性增强[16]。小麦中，TaRLCK-VII家族成员TaRLCK1B基因与水稻抗病相关基因OsRLCK176（RLCKs-VII）的同源性为84.03%，该基因在小麦抗病品种中的表达量显著高于感病品种；利用VIGS （virus induced gene silencing）技术沉默TaRLCK1B后接种麦瘟病菌（R. cerealis），沉默植株对麦瘟病菌的抗性降低，但其H2O2含量显著提高，由此可见，TaRLCK1B基因通过调控小麦体内ROS信号应对R. cerealis早期免疫应答[17]。

综上所述，RLCK-VII家族基因参与植物免疫响应，在调控植物逆境胁迫应答过程中起重要作用，但该类基因在棉花中的报道甚少。因此，本研究利用前期从海岛棉中获得的响应黄萎病菌和激素（水杨酸salicylic acid，SA；乙烯ethylene，ET；茉莉酸methyl jasmonic acid，MeJA）胁迫的RLCK基因GbRLCK10[18]，通过农杆菌介导法将该基因导入烟草，研究其在烟草中的功能，为深入研究GbRLCK10基因在海岛棉中的时空表达及作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验烟草材料为野生型烟草SR1（Nicotiana tabacumpv SR1），根癌农杆菌为GV3101，植物基础表达载体为pCAMBIA2300-35s-OCS，黄萎病菌菌株为v592，以上材料均由本实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 重组质粒构建及转化农杆菌 根据GbRLCK10基因的开放阅读框序列设计引物；通过酶切、连接构建植物表达载体重组质粒（pCAMBIA2300-35s-OCS:GbRLCK10）；采用电击法将重组质粒导入根癌农杆菌GV3101，利用菌液PCR法筛选鉴定阳性菌株。

1.2.2 烟草遗传转化 利用农杆菌介导法进行烟草遗传转化，转化过程中所需要的培养基配方及转化方法参考文献[19]。

1.2.3 转基因烟草检测 T0代转基因阳性株筛选：依据CaMV35S启动子序列设计上游引物35SF1，依据目的基因序列设计下游引物GeneR1，以转基因烟草与野生型烟草的基因组DNA为模板进行PCR扩增，转基因植株的扩增片段预计600 bp左右，PCR程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30 个循环；72 ℃ 7 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

T1/2代转基因阳性株筛选：将烟草种子表面消毒后平铺于含有50 mg·L-1卡那霉素的固体1/2 MS培养基上进行筛选，植株正常生长、叶片为绿色的为转基因植株；植株发芽后停止生长、叶片变白的为非转基因植株。选取转基因植株的cDNA为模板进行RT-PCR，扩增片段预计约1 200 bp，引物为目的基因引物（GbRLCK-F和GbRLCK-R），PCR程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃60 s，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 烟草DNA和RNA提取 试验所需DNA和RNA均使用试剂盒提取，分别为 DNAsecure Plant Kit 新型植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技北京有限公司）和EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司），提取过程严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.5 烟草抗病性鉴定 将黄萎病菌菌株V592接种至PDA培养基活化，将已活化菌株接种至查氏液体培养基，28 ℃振荡培养4 d后，配制为1×107·mL-1孢子悬浮液待用；于烟草幼苗长至5~6片真叶时，选取生长一致的烟草采用灌根法接种黄萎病菌，接种后每天观察烟草病害的发生情况[20]，待发病高峰期统计病情指数。按以下标准统计病级。0级：植株无发病叶片；1级：植株有发病叶片，且发病叶片少于25%；2级：植株25%~50%叶片发病；3级：植株50%～75%叶片发病；4级：植株75%以上叶片发病。病情指数计算公式如下。

1.2.6 抗病相关基因表达特性分析 将已活化菌株V592接种至查氏液体培养基，28 ℃振荡培养4 d后，配制浓度为1×107·mL-1孢子悬浮液待用；于烟草幼苗长至5～6片真叶时，选取生长一致的烟草采用灌根法接种黄萎病菌，分别在侵染0、24、72、120和168 h采集野生型和转基因植株从上至下的第3片真叶，液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱。

利用qRT-PCR技术，以NtActin为内参基因，分析NtPR1、NtNPR1、NtEIN4、NtJAZ1、NtNTHK、NtAOS在转基因植株和野生型植株感病前和感病后的表达模式。基因表达量检测所需的试剂盒购于中国北京全式金生物技术有限公司。qRT-PCR反应体系及程序严格按照试剂盒说明书操作，试验设3个重复，采用2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量。

表1 引物序列Table 1 Sequence of pimers

1.3 数据分析

采用Excel 2010进行数据整理，采用GraphPad Prism 8软件作图，采用SPSS 19.0进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 农杆菌介导的烟草遗传转化

2.1.1 重 组 质 粒 （pCAMBIA2300-35s-OCS：GbRLCK10）转化农杆菌 将构建好的植物表达载体（pCAMBIA2300-35s-OCS:GbRLCK10）导入农杆菌，利用菌液PCR鉴定阳性菌株，目的基因为1 179 bp（图1）。

图1 GbRLCK10基因PCR扩增Fig. 1 PCR amplification results of GbRLCK10 gene

2.1.2 烟草的遗传转化及阳性植株筛选 采用农杆菌介导法转化烟草(图2A～D)，并获得T0转基因植株（图2E和F），分别提取野生型和T0转基因植株DNA，以野生型烟草为阴性对照进行PCR鉴定，结果表明，转基因烟草中有11株扩增出预期大小（约600 bp）的目的条带，初步证明GbRLCK10基因已整合到烟草基因组中（图2G）。对T1/2转基因植株提取RNA，反转录获得cDNA后，利用RT-PCR进一步检测，11株转基因的烟草均扩增出预期大小（约1 200 bp）的目的条带（图2H和I）。由此说明，GbRLCK10基因已整合到烟草基因组中，且能够正常转录。选取OE2、OE3和OE5共3株转基因株系进行后续试验。

图2 GbRLCK10基因转化烟草化及阳性植株筛选Fig. 2 Transformation of GbRLCK10 gene into Nicotiana tabacum and screening of positive plants

2.2 抗病性鉴定

采用灌根法对转基因烟草和野生型烟草接种棉花黄萎病菌菌株V592，结果（图3）显示，接种病原菌约7～10 d，转基因植株和野生型植株的叶子出现不同程度褶皱，叶脉附近慢慢变黄；转基因烟草在接种20～22 d开始发病，33 d时达到发病高峰期；野生型烟草在接种28～31 d开始发病，42 d时达到发病高峰期。由此表明，与野生型相比转基因烟草更易感病。

图3 烟草抗病性鉴定Fig. 3 Tobacco disease resistance identification

2.3 抗病相关基因表达量分析

接种病原菌前，抗病相关基因在野生型和转基因植株中的表达如图4所示。野生型烟草中NtNPR1、NtPR1、NtJAZ1基因的表达量均显著或极显著低于转基因植株，而NtEIN4、NtNTHK2、NtJAZ1基因的表达量均显著或极显著高于转基因植株。

图4 黄萎病菌处理前抗病相关基因在野生型和转基因植株中的表达Fig. 4 Expression of disease resistance-related genes in WT and transgenic plant before treatment with Verticillium dahliae

接种黄萎病菌后，抗病相关基因在野生型和转基因植株中的表达如图5所示。NtNPR1基因在野生型中的表达量随着接种时间的推进先升高再降低，在接种后72 h表达量最高，为接种前的2.1倍；而转基因植株中NtNPR1基因的表达量均高于野生型。NtPR1基因在野生型烟草中表达量在处理时间段内持续升高，在接种后168 h表达量最高，约为对照的380倍；转基因植株在处理时间点内该基因的表达量均低于野生型。NtEIN4基因在野生型植株中的表达量随接种时间的延长，表达量均低于对照；而转基因植株中该基因的表达量均高于野生型，且随接种时间的延长表达量呈上升趋势。NtNTHK2和NtJAZ1基因无论是在野生型还是在转基因植株中，随着接种时间的延长，该基因的表达量均低于对照；但转基因植株中的表达量均高于野生型。NtAOS基因无论是在野生型还是在转基因植株中，随着接种时间的延长，该基因整体表达量均高于对照；且野生型中的表达量高于转基因植株。

图5 黄萎病菌处理后抗病相关基因在野生型株系与转基因株系中表达Fig. 5 Expression of disease resistance related genes in wild type and transgenic strains after treatment with Verticillium dahliae

3 讨论

RLCK家族基因位于植物细胞表面，被称为模式识别受体（PRRs），通过感知PAMPs（pathogen-associated molecular patterns）激活下游信号转导[21-22]。研究表明，该类基因在PTI中起着重要作用，广泛地参与植物免疫响应、信号传导及防御过程，在拟南芥中，RLCK VII亚家族成员BIK1 和PBS1是多个PRR复合物的直接底物[22]；在水稻中，赖氨酸基序（LysM）受体样激酶CERK1是植物对微生物相关分子模式（MAMPs）免疫应答所必需的辅助受体，属于水稻RLCK家族VII亚家族，与CERK1相互作用，并正向调节对肽聚糖和几丁质反应[23]。由此可见，RLCK家族基因以正调控或负调控的作用方式参与复杂的抗病信号途径[24]。

本研究前期从海岛棉中获得响应黄萎病菌和激素（水杨酸、茉莉酸、乙烯）胁迫的基因GbRLCK10，并通过农杆菌介导法将其转入烟草，对其在烟草中的功能进行初步研究，结果表明，在烟草中过表达GbRLCK10基因，转基因植株对黄萎病菌的抗性较野生型有所降低。研究表明，类受体胞质激酶基因CPK28在拟南芥中过表达后，转基因植株中BIK1蛋白积累较少，致使免疫受损，对病原菌的抵抗力下降，而该基因的突变体中BIK1蛋白积累较多，对病原菌的抗性增强[25]，与本研究结果一致，但GbRLCK10基因是否如CPK28基因通过影响某些蛋白的积累从而影响植物对病原菌的抗性有待进一步研究。

研究表明，水杨酸、茉莉酸和乙烯是植物抗病信号转导途径中重要的信号分子[18]。水稻中，RLCK VII家族成员的OsPBL1基因能被水稻条纹叶枯病诱导表达，将其转入拟南芥后，转基因植株对丁香假单胞菌的抵抗性较野生型增强，叶片中过氧化氢与胼胝体的积累量均高于野生型，水杨酸途径中关键基因PR1、PR2和PR5的表达量均高于野生型[26]。编码类受体胞质激酶蛋白基因NRRB能被水杨酸、氨基环丙烷羧酸（l-aminocyclopropane-lcarboxylic acid，ACC）抑制表达，而MeJA对NRRB具有双向调控，既可以诱导NRRB表达，也可以抑制NRRB表达，表明类受体胞质激酶家族基因参与了水杨酸与茉莉酸信号通路[27]。以上研究表明，类受体胞质激酶家族基因参与调控激素信号通路基因影响植物抵御外界逆境胁迫。

NPR1基因对水杨酸信号途径中R基因的激活具有重要调控作用。本研究表明，健康状态下，NtNPR1、NtPR1基因在转基因植株中的表达量高于野生型；接种黄萎病菌后，野生型烟草中NtNPR1基因上调表达，NtPR1基因表达量随接种时间持续升高，转基因植株中，NtNPR1基因表达量高于野生型，但NtPR1基因表达量低于野生型。Yan等[28]研究发现，水杨酸通路为SA→NPR1→TGA→PR-1→抗病。将GbRLCK10基因导入烟草后，无论是病原菌接种前还是接种后转基因植株中NtNPR1基因的表达量均高于野生型，但NtPR1基因表达量低于野生型，推测GbRLCK10基因可能通过调控TGA转录因子影响NtPR1基因表达，从而影响烟草对黄萎病的抗性。

研究表明，乙烯可以调控植物对腐生型病原菌的抗性[29-30]。棉花与黄萎病菌相互作用的机理非常复杂，Shaban等[31]认为乙烯和茉莉酸信号通路协同作用对抗腐生病原体，在适当的时候乙烯下游信号分子通过与JA信号相互作用，参与黄萎病的抗性。本研究结果显示，接种黄萎病菌前，转基因植株中NtEIN4和NtNTHK2基因的表达量均低于野生型；接种黄萎病菌后，NtEIN4基因在野生型和转基因植株中的表达模式相反，野生型中，该基因表现为随着接种时间下调表达，但在转基因植株中表现为上调表达，NtNTHK2基因在野生型和转基因植株中均为下调表达，但该基因在转基因植株中的表达量高于野生型。研究发现，拟南芥中的乙烯受体主要包括ETR1、ERS1、ETR2、ERS2、EIN4，这些受体间具有一定功能冗余性，是乙烯信号的负调控因子[32]。而烟草中乙烯受体基因的研究较少，除上述蛋白受体外，NtNTHK1、NtNTHK2为烟草中的乙烯受体蛋白[33]，研究表明， NtNTHK2蛋白是烟草中乙烯受体第二亚族的成员，NtNTHK2基因与拟南芥乙烯受体基因EIN4、ETR2和ETR1的同源性分别为56.3%、46.4%和32.8%[34]，由此推测，烟草中NTHK2蛋白功能与拟南芥EIN4功能相似，结合本研究结果，推测GbRLCK10基因导入烟草后通过调控乙烯受体基因NtEIN4和NtNTHK2的表达来调节烟草对黄萎病的抗性。

茉莉酸在植物抵抗生物胁迫和非生物胁迫过程中发挥重要作用[35]。拟南芥中茉莉酸信号通路的核心元件有COIl、JAZ蛋白和转录因子MYC2，其中JAZ蛋白作为茉莉酸信号通路的负向调控因子在介导植物抗病反应中起重要作用[36-38]。当JAZ基因缺失或表达量下降后，拟南芥对P.syringae的抗性明显减弱[38]。丙二烯氧化物合成酶（allene oxide synthase, AOS）普遍存在于植物组织中，是茉莉酸合成通路的关键酶[39]。当植物受到生物胁迫时该基因表达，通过控制茉莉酸的生物合成而参与调节植物生理过程，本研究表明，接种黄萎病菌前，转基因植株中NtAOS基因的表达量低于野生型，NtJAZ1基因表达量高于野生型；接种黄萎病菌后，NtAOS基因在野生型和转基因植株中均能被诱导表达，但在野生型中表达量更高。Yan等[28]通过分析黄萎病菌侵染海岛棉的转录组发现，AOS基因在抗性品种中表达量更高，与本研究结果一致。在接种黄萎病菌前，NtJAZ1基因在转基因植株中的表达量高于野生型；而接种黄萎病菌后，该基因在转基因植株中的表达量也高于野生型，由此推断，茉莉酸途径参与了烟草对黄萎病菌的响应，而GbRLCK10基因通过调节茉莉酸途径NtJAZ1和NtAOS基因表达来调控转基因植株对黄萎病菌的抵抗力。