周志成，孙 海，肖仲久，莫维弟，程欢欢，彭丽娟，丁海霞,5

(1贵州大学农学院,贵州 贵阳 550025；2北京市植物保护站,北京 100011；3遵义师范学院资源与环境学院,贵州 遵义 563002；4贵州大学烟草学院,贵州 贵阳 550025；5贵州省农业科学院,贵州 贵阳 550006)

辣椒Capsicum annuum是贵州省主要的经济作物之一，2020年，贵州省辣椒种植面积达36万hm2，全国第一，产值达242亿元，约占全国的1/6，全球的1/10[1]。随着贵州省辣椒种植面积不断扩大，辣椒真菌性病害的为害也在逐年加剧。辣椒的真菌性病害多达15种，可造成辣椒生产减产20%～50%，其中，由链格孢属Alternaria sp.真菌引起的黑斑病、镰刀菌属Fusarium sp.真菌引起的根腐病和炭疽菌属Colletotrichum sp.真菌引起的炭疽病为害较严重[2]。李小霞等[3]调查了贵州省遵义、湄潭、清镇、花溪和大方等地辣椒炭疽病的发病情况，结果显示黑色炭疽菌C.nigium、黑点炭疽菌C.capsici和胶孢炭疽菌C. gloeosporioides是引起这些地区辣椒炭疽病的主要病原菌，明确了75%(w)甲基布拖津WP对C.nigium菌丝生长具有较好的抑制效果。王妮等[4]从贵阳市花溪区磊庄村辣椒基地分离得到1株辣椒炭疽病病原菌，鉴定为尖孢炭疽菌C.acutatum，且30%(w)吡唑醚菌酯SC与25%(w)咪鲜胺EC对病原菌菌丝生长的抑制效果最好，此外，大豆炭疽菌C.truncatum、菠菜炭疽菌C.spinaciae、博宁炭疽菌C.boninense、斯高威尔炭疽菌C.scovillei等炭疽菌属真菌也是辣椒炭疽病的致病菌[5-6]。因此，鉴定辣椒炭疽病病原菌种属并有针对性地进行防治药剂筛选，对辣椒炭疽病防控具有重要意义。

利用化学手段防治辣椒炭疽病仍是关键且有效的措施，常用的化学杀菌剂有味鲜胺、甲基硫菌灵、多菌灵和代森锰锌等，但长期单一使用某种化学药物，不仅使病原菌产生抗药性，还加剧土壤中农药残留等问题[7]。不同类型化学农药交替施用或配合施用，可有效解决上述问题[8]。采用对环境友好的生物农药，不仅能改善土壤微生物结构，也能提高植株抗病性[9-10]。本研究对贵州省花溪区辣椒炭疽病菌进行分离鉴定及致病力测定；通过测定12种杀菌剂及其混配药剂对辣椒炭疽病菌的毒力作用，筛选对该病菌具有抑制作用的化学药剂，以期为辣椒炭疽病的防治提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

标本均采自贵州省花溪区辣椒种植基地辣椒炭疽病发病严重地块，选取带有典型病症的病叶或病果，共采集样品11份，其中，病果5份，病叶6份。供试辣椒品种为‘党武’。

培养基为水琼脂培养基(WA)和马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)[11]。

化学杀菌剂：75%(w)肟菌·戊唑醇WDG购自拜耳作物科学(中国)有限公司北京分公司；10%(w)苯醚甲环唑WDG购自先正达南通作物保护有限公司；250 g/L吡唑醚菌酯SC购自江苏托球农化股份有限公司；227 g/L二氰蒽醌SC购自江西禾益化工股份有限公司、500 g/L丙环唑ME购自山东省青岛格力斯药业有限公司；250 g/L溴菌腈EC购自江苏托球农化股份有限公司。

植物源杀菌剂：10 g/L蛇床子素ME购自云南南宝生物科技有限责任公司；200 g/L异硫氰酸烯丙酯EW购自江苏腾龙生物药业有限公司；200 g/L异硫氰酸烯丙酯SL购自北京亚戈农生物药业有限公司。

微生物源杀菌剂：3%(w)中生菌素WP购自深圳诺普信农化股份有限公司；10 g/L申嗪霉素SC购自上海农乐生物制品股份有限公司；80 g/L宁南霉素AS购自德强生物股份有限公司。

1.2 病原菌分离与鉴定

1.2.1 病原菌的分离病原菌分离采用单孢分离法[12]，并稍加改动。在体视镜下用无菌手术刀将病样上的分生孢子堆切下，置于无菌水中，用移液枪反复吸打将分生孢子堆分散混匀，吸取100μL孢子悬浮液放入WA平板中均匀涂布，室温下正置培养8～12 h后，在显微镜下用无菌手术刀挑取单个已萌发的分生孢子，转移至PDA平板上，25℃、黑暗条件培养7 d后观察菌落形态。

1.2.2 病原菌的致病性将纯化的菌株接种于PDA平板上，于25℃条件下培养7～14 d，待产孢后，将分生孢子冲洗制成孢子悬浮液，用血球计数板计算悬浮液孢子数量，最终将数量调整至1.0×106/m L。采用刺伤接种法，参考Than等[13]的方法并稍加改动。健康辣椒果实和叶片用φ为75%乙醇溶液表面消毒30 s，无菌水清洗3次后晾干备用。将表面消毒的果实和叶片置于含有滤纸的保鲜盒(长、宽、高为10 cm×8 cm×5 cm)中。采用无菌接种针刺伤供试植物组织，在刺伤处滴加10μL孢子悬浮液，阴性对照滴加10μL无菌水，每个处理重复3次。接种好的植物材料置于光照培养箱中培养，光照周期为12 h光∶12 h暗，湿度(w)为80%，温度为25 ℃，2 d后观察并记录发病情况。

1.2.3 病原菌的形态观察利用Leica S8APO体式显微镜和Olympus BX 53光学显微镜对病原菌进行观察，并拍照记录菌落特征和孢子形态。参照刘方玲[14]的研究方法进行附着胞的观察，将28℃条件下培养7 d的病原菌用无菌水洗脱配制孢子悬浮液，在显微镜10×40倍下每视野观察孢子约30～50个，选取无菌载玻片，在其中央滴1滴孢子悬浮液，置于28℃条件下保湿培养24～48 h，观察附着孢的形成。

1.2.4 病原菌分子鉴定根据真菌DNA提取试剂盒(Biomiga Fungal gDNA Kit)说明书提取病原菌基因组DNA，分别选择内转录间隔区(Internal transcribed spacers，ITS)、肌动蛋白基因(Actin gene，ACT)、几丁质合成酶(Chitin synthase 1，CHS-1)和3–磷酸甘油醛脱氢酶(3-Ghosphate-glycerol aldehyde dehydrogenase，GAPDH)基因引物(表1)进行PCR扩增，扩增产物采用10 g/L的琼脂糖凝胶进行电泳检测，检测合格后将扩增产物送往上海生工生物技术有限公司进行测序。将测序所得序列在GenBank数据库中进行比对，参照Damm等[18]的研究选取相关炭疽菌株基因序列(表2)，用系统发育分析软件MEGA X执行最大简约法(Maximum likelihood，ML)[19]构建系统发育树。本研究所得的序列提交到 NCBI的GenBank 数据库，并获取相应的序列号(表2)。

表1 本研究所用的引物Table1 Primers used in this study

表2 多基因序列分析所用菌株信息1)Table 2 Species used for multi-gene phylogeny analysis in this study

1.3 杀菌剂敏感性测定

1.3.1 单剂毒力测定采用菌丝生长速率法[11]进行室内药剂筛选。将各供试药剂用无菌水配制成母液，母液浓度为终浓度的10倍，然后以体积比1∶9分别加至冷却至45℃的PDA 培养基中，充分摇匀后制成含药平板，终质量浓度见表3。用打孔器在供试菌株菌落边缘处打取0.5 cm菌饼，用接种针挑取菌饼接种在PDA平板的中央，以无菌水作对照，每个浓度3次重复，25℃条件下培养7 d，采用十字交叉法量取菌落直径(D)，计算抑制率。

表3 供试杀菌剂及有效成分质量浓度Table3 Fungicides and the contentrations of active ingredients used in this study

1.3.2 混剂毒力测定根据单剂毒力测定结果，选择作用机制不同且抑制效果较好的2种杀菌剂以不同的体积比(4∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶4)进行复配，每个体积比设置5个浓度梯度，每个梯度设置3次重复，计算EC50，采用黄清臻等[20]的方法计算共毒系数(Co-toxicity coefficient)。

1.4 数据处理

使用Excel和DPS软件进行数据整理和分析。

2 结果与分析

2.1 致病性测定

通过对采集的典型炭疽病发病叶片和果实进行单孢分离，从11份培养物中共分离得到8株具有致病力的菌株，分离率为72.7%，其中，菌株HGUPLJ169致病力最强。菌株HGUPLJ169致病性测定结果如图1所示，有伤接种的辣椒叶片在3 d后开始表现出病害症状，发病中心呈灰白色至深棕色，病斑边缘呈现黄色，对照叶片无发病症状(图1A、1B)。有伤接种的辣椒果实在5 d后开始表现病害症状，发病中心灰白色至深褐色，病斑凹陷，呈长椭圆形，边缘呈黑色，对照果实无发病症状(图1C、1D)。发病叶片和果实症状与原病害样本症状一致，对接种发病叶片和果实进行病原菌的再分离，经鉴定与原接种菌种相同，符合科赫氏法则，以上结果证明菌株HGUPLJ169为‘党武’辣椒炭疽病的致病菌。

图1 菌株HGUP LJ169致病性测定Fig.1 Pathogenicity test of HGUP LJ169

2.2 形态学鉴定

如图2所示，菌株HGUP LJ169在PDA培养基上于28 ℃条件下培养7 d后菌落直径达8.0～9.0 cm。菌落圆形，边缘整齐，菌丝致密、羊绒状，白色至浅灰色，菌落中心隆起呈灰白色同心轮纹状生长，菌落背面橘黄色至灰黑色，有时在背面有深色斑点(图2A、2B)。分生孢子附着胞棕色，卵圆形或圆形，边缘整齐；大小为：4.1～4.9×6.7～11.4μm，=(4.53±0.49)×(8.73±0.93)，n=30(图2C～2F)；分生孢子单胞、无色、壁光滑，圆柱状，两端钝圆，有油球，大小为：3.1～8.2×4.6～17.2μm，=(4.16±0.37)×(12.67±1.47)，n=50(图2G)，根据菌株的形态学特征，初步鉴定菌株为Colletotrichum sp.。

图2 菌株HGUP LJ169的形态特征Fig.2 Morphological characteristics of HGUP LJ169

2.3 系统发育树分析

采用ITS、ACT、CHS-1、GAPDH等基因序列构建多基因联合系统发育树，如图3所示，在以C.acutatum CBS 129921和C.acutatum CBS 129922菌株为外群的系统发育树中，菌株HGUP LJ169与C. scovillei CBS 126529以100%的支持率聚集于一支，并与其他种明显区分开。与菌株C.scovillei CBS 126529相比，ITS序列相似性达100%，ACT序列相似性达100%，CHS-1序列相似性达99%，GAPDH序列相似性达100%。因此，结合菌株形态学特征，将菌株HGUPLJ169鉴定为斯高维尔炭疽菌C.scovillei。

图3 基于ITS、ACT、CHS-1、GAPDH基因序列的菌株系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of bacterial strains based on ITS, GADPH,CHS-1 and ACT gene sequences

2.4 12种杀菌剂的敏感性测定

由表4可见，12种杀菌剂对辣椒炭疽病菌C.scovillei均表现出一定的抑制效果，但对菌丝生长的抑制效果不同，毒力差异较大。所选用的6种化学药剂中，75%(w)肟菌·戊唑醇WDG、10%(w)苯醚甲环唑WDG和250 g/L吡唑醚菌酯SC抑菌效果最好，其EC50分别为0.254、0.731和0.745 mg/L；所选用的6种生物农药中，200 g/L异硫氰酸烯丙酯SL和3%(w)中生菌素WP抑菌效果较好，其EC50分别为1.238和1.307mg/L。

表4 12种杀菌剂对Colletotrichum scovillei的抑制效果Table 4 Inhibitory effects of twelve fungicides against Colletotrichum scovillei

2.5 混配药剂共毒系数计算

由表5可见，将250g/L吡唑醚菌酯SC和10%(w)苯醚甲环唑WDG按照体积比为4∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶4配比进行混配并测定其共毒系数及联合毒力，结果表明，配比组合为4∶1、3∶2、1∶1、2∶3和1∶4时，EC50均较小，且明显小于2种单剂的EC50。5种配比组合的共毒系数分别为635.953、420.795、125.992、108.012、95.836，说明以这5种配比组合进行混配均对该辣椒炭疽病菌具有较好的抑制作用。配比为4∶1、3∶2和1∶1时其共毒系数大于120，表现出明显的增效作用；配比为2∶3和1∶4时其共毒系数大于80，小于120，表现出相加作用。综合以上，5种药剂配比中，250 g/L吡唑醚菌酯SC和10%(w)苯醚甲环唑WDG体积比为4∶1时为最佳配比。

表5 苯醚甲环唑WDG和吡唑醚菌酯SC对Colletotrichum scovillei的联合毒力作用Table 5 Co-toxicity of the mixed difenoconazole WDG and pyraclostrobin SC to Colletotrichum scovillei

3 结论与讨论

本研究中通过病原菌分离和致病力测定，依据病原菌形态学，结合ITS、GADPH、CHS-1和ACT基因序列构建系统发育树对比分析，将菌株HGUPLJ169鉴定为C.scovillei。由C.scovillei引起的辣椒炭疽病在安徽、甘肃、美国南卡罗来纳州、日本岛根县、韩国、巴西等地均有发现，而在贵州鲜见报道[21-25]。C. scovillei侵染后发病速度快、传染性强，具有很强的寄主组织专化性，能够危害芒果、苹果等，对果实产量和品质造成一定的影响[26-27]。结合本研究，表明贵州省花溪区辣椒炭疽病可由C.scovillei引起，明确病原菌的分类地位有利于为后续研究其病害的防治提供依据。

本研究以菌株HGUPLJ169为靶标病原菌，采用菌丝生长速率法测定了C.scovillei对生产中常用的12种杀菌剂的敏感性。结果表明，所选用的6种化学杀菌剂对C.scovillei均表现出一定的抑制效果，其中75%(w)肟菌·戊唑醇WDG、10%(w)苯醚甲环唑WDG和250 g/L吡唑醚菌酯SC抑菌效果最好；同时在测定单一化学杀菌剂室内抑制效果的基础上，选用了2种作用机制不同的化学杀菌剂，10%(w)苯醚甲环唑WDG和250 g/L吡唑醚菌酯SC在不同体积配比下对C.scovillei的室内抑制作用，2种药剂的复配抑制效果较好，其中最佳配比体积比为4∶1，可用于下一步的辣椒炭疽病田间药剂筛选。所选用的6种生物杀菌剂(3种微生物源杀菌剂和3种植物源杀菌剂)均具有一定的防治潜力，200 g/L异硫氰酸烯丙酯SL和3%(w)中生菌素WP抑菌效果较好；6种生物杀菌剂的抑菌效果均优于溴代氰烷烃类杀菌剂(250 g/L溴菌腈EC)、三唑类杀菌剂(500 g/L丙环唑ME)和醌类杀菌剂(227 g/L二氰蒽醌SC)。研究结果表明C.scovillei对溴菌腈、丙环唑和二氰蒽醌的敏感性较低，其原因可能是生产中长期使用这3种药剂，导致C. scovillei产生了一定抗性。长期或同时使用同种类型杀菌剂可能会导致病原菌产生抗药性，炭疽菌对甲氧基氨基甲酸酯类杀菌剂和三唑类杀菌剂的自发突变频率较高，且存在一定的抗性分化[28-30]。若长时间单一使用某种杀菌剂，可能会导致病原菌产生抗药性，不同类型杀菌剂交替或配合使用，可延缓抗药性的产生，延长药剂的使用寿命。本研究可为生产中常用防治辣椒炭疽病药剂的替代药剂或轮换药剂的使用提供参考。