王锦坡, 黄月红, 陈运新, 陈治新, 陈丰霖

肝纤维化(liver fibrosis, LF)是肝组织内细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的平衡被打破,导致肝脏结构和功能发生改变的一种病理变化,出现在慢性肝病的所有类型中。若LF无法得到控制,将导致肝硬化或肝癌,甚至进展为肝衰竭乃至死亡。全球每年死于肝硬化的 100 万例患者中,我国就占了约1/3[1]。研究[2-3]表明,若病因能得到有效控制,LF可逆转。因此,寻找并探索新的治疗方法逆转或阻止LF已势在必行。

长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一类长度>200 nt的非编码RNA,可参与许多疾病的病理和生理过程,包括细胞分化和发育、肿瘤的发生和迁移、器官和组织纤维化[4]。近年来,多项研究[5-9]结果表明,lncRNAs可在多种脏器的纤维化组织中异常表达,并参与纤维化的调节,lncRNAs本身、其结合蛋白和靶基因均可能成为新的治疗靶点,特别是在LF的发生过程中,已发现有多种异常表达的lncRNAs,如MALAT1、lnc-LFAR1、HIF1A-AS1和GAS5[6,8-9]等。

锌指蛋白反义链1(zinc finger antisense 1, ZFAS1)是新发现的一种长链非编码RNA,定位在染色体20q13,位于含 NFX-1 型锌指结构(zinc finger NFX-1-type containing, Znfx1)启动子区域的反义链上,是 3 种小核仁RNA的宿主[10]。研究[11]发现,ZFAS1在原发性肝细胞癌(hepatic cell carcinoma, HCC)患者中高表达,与肝内、外转移及HCC预后不良有关[12-13]。此外,ZFAS1参与多种脏器或组织纤维化的发展。YANG等[14]在肺纤维化(pulmonary fibrosis, PF)的研究中发现,lncRNA ZFAS1通过 ZFAS1/miR-150-5p/SLC38A1轴参与PF的发生,并可能成为治疗PF的新标志物。本研究拟探讨ZFAS1在LF组织和细胞中的表达情况及作用机制,为LF提供新的诊断及治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物及细胞 6～8周龄雄性SPF级C57小鼠[北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号SCXK(京)2016-0006]。NCTC1469(CL-0407)、AML12(CL-0602)(上海普诺赛公司)。

1.2 试剂 AML12细胞专用培养基(上海普诺赛公司);转化生长因子-β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1,美国Affinity公司);四氯化碳(CCl4,湖南汇虹试剂有限公司);橄榄油(上海源叶生物科技有限公司);Trizon Reagent、Ultrapure RNA 超纯RNA提取试剂盒(CWBIO,中国康为世纪公司);HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(南京诺唯赞生物科技股份有限公司);α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA,美国Proteintech公司);Ⅰ型胶原α1(collagen Ⅰα1, Col1α1,美国Affinity公司);基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2,英国Abcam公司);辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金桥公司);羟脯氨酸(hydroxyproline, HYP)测定试剂盒(南京建成公司)。

1.3 方法

1.3.1 LF模型构建 小鼠按随机数据表分为对照组(n=5)和模型组(n=5)。模型组小鼠腹腔注射体积分数为10% CCl4(溶于橄榄油,2 mg/kg),每周 2 次,诱导小鼠LF模型。对照组小鼠腹腔注射相应体积的橄榄油。于第6周末处死小鼠,留取肝组织样品。

1.3.2 苏木精-伊红染色(H-E染色) 4%多聚甲醇固定的肝组织经梯度乙醇脱水,常规透明,浸蜡。石蜡包埋,切片。H-E染色,中性树脂封片。镜检观察肝组织病理变化。

1.3.3 天狼猩红染色 取出肝组织石蜡切片,常规脱蜡水化。用天狼星红染色液染色1 h,流水冲洗;Mayer苏木精染细胞核10 min,流水清洗;95%乙醇脱水(5～10 s脱水3次),二甲苯胺透明3次,后用中性树胶封固。

1.3.4 免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC) 组织切片放入65 ℃烤箱中烤2 h,在二甲苯共放置20 min,乙醇梯度脱水,纯化水冲洗。用柠檬酸缓冲液抗原修复,去除内源性过氧化物酶。常规方法37 ℃非特异性封闭30 min。敷一抗α-SMA(1∶100)、Col1α1(1∶100)。敷二抗辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(1∶100)。DAB显色,苏木精复染,盐酸乙醇分化,返蓝;冲洗、脱水、透明、封片、镜检。使用Image J软件进行半定量分析。

1.3.5 ELISA检测样本的光密度(optical density, OD)值 小鼠肝组织分组处理后,严格按照试剂盒说明书操作,在光径 1 cm、波长550 nm条件下测各样本的OD值,计算HYP含量。

1.3.6 细胞转染 NCTC1469细胞按以下分组进行转染:对照组、干扰对照组、hZFAS1-697、hZFAS1-539 和hZFAS1-624。当细胞密度达70%时准备转染,转染剂量以 6 孔板 1 个孔计算,按照说明书转染细胞。将转染48 h后的细胞进行检测。各siRNA序列见表1。

表1 siRNA序列

1.3.7 实时荧光定量聚合酶链反应(real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR) 收集对照组及模型组的肝组织细胞,用超纯RNA提取试剂盒进行RNA提取,将RNA反转录为cDNA。对各组细胞中目的基因的表达进行检测。收集上述各组NCTC1469细胞,用超纯RNA提取试剂盒提取RNA,并将RNA反转录为cDNA。检测上述各组细胞中目的基因的表达。反应如下:预变性95 ℃ 10 min→变性95 ℃ 10 s→退火58 ℃ 30 s→延伸72 ℃ 30 s;40个循环。引物序列见表2。

表2 各引物序列信息及PCR反应条件

1.3.8 Western-blot检测蛋白含量 各组细胞加入裂解液裂解,获得各组细胞的总蛋白,测定各组细胞蛋白含量。蛋白变性后,行凝胶电泳试验,湿法转膜。加一抗,4 ℃过夜孵育;加二抗,室温孵育 1～2 h。在凝胶成像系统中曝光。采用Quantity one软件分析各抗体条带的灰度值。

2 结 果

2.1 纤维化小鼠肝脏病理组织形态学改变 与对照组比较,模型组小鼠肝组织内炎性细胞浸润增多,纤维结缔组织生成明显增多(H-E染色,图1A);模型组小鼠肝组织内胶原纤维蛋白合成增加,大量沉积(天狼猩红染色,图1B)。

A:H-E染色;B:天狼猩红染色。模型组:CCl4处理组。

2.2 纤维化小鼠肝组织α-SMA 和 Col1α1 表达情况 肝组织IHC染色显示,α-SMA阳性着色主要位于血管周围和肝窦内肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)的细胞质,而Col1α1蛋白阳性着色主要位于肝组织纤维间隔(图2A)。半定量结果显示,与对照组比较,模型组中的α-SMA、Col1α1蛋白表达水平明显升高,差别有统计学意义(P<0.05,图2B)。

α-SMA:α-平滑肌肌动蛋白;Col1α1:Ⅰ 型胶原α1;IHC:免疫组织化学。模型组:CCl4处理组。A:IHC染色检测肝组织 α-SMA和Col1α1表达定位;B:半定量分析肝组织 α-SMA和Col1α1表达。与对照组比较,△:P<0.05。

2.3 纤维化小鼠肝组织中HYP的含量 与对照组比较,模型组小鼠肝组织的HYP含量明显升高(P<0.05,图3),提示CCl4处理可促进胶原产生。

HYP:羟脯氨酸。与对照组比较,△:P<0.05。

2.4 纤维化小鼠肝组织 lncRNA ZFAS1 表达 与对照组比较,模型组小鼠肝组织中lncRNA ZFAS1表达水平显著增高,差别有统计学意义(P<0.05,图4)。

ZFAS1:锌指蛋白反义链1。与对照组比较,△:P<0.05。

2.5 小鼠肝细胞系NCTC1469和AML12细胞中lncRNA ZFAS1表达变化 为进一步探讨lncRNA ZFAS1在LF进展中的作用,体外通过qRT-PCR检测小鼠永生化正常肝细胞系NCTC1469和AML12细胞内源性lncRNA ZFAS1表达水平。与AML12细胞比较,NCTC1469细胞中 lncRNA ZFAS1表达水平显著升高(P<0.05,图5)。因此,后续RNA干扰实验将以NCTC1469细胞作为实验对象。

ZFAS1:锌指蛋白反义链1。与对照组比较,△:P<0.05。

2.6 lncRNA ZFAS1 敲低细胞株的构建 在NCTC1469细胞分别脂质体转染不同靶点的siZFAS1片段(siRNA-697、siRNA-539和siRNA-624),qRT-PCR检测各组NCTC1469中lncRNA ZFAS1的表达(图6),3 种siZFAS1片段均可有效抑制ZFAS1表达。与空白对照组比较,siRNA对照组lncRNA ZFAS1的表达无明显变化(P>0.05);与阴性对照组(siRNA NC)比较,siRNA-697、siRNA-539和siRNA-624组的lncRNA ZFAS1表达均显著下降,差别有统计学意义(P<0.05),其中siRNA-539下降最为明显,故后续干扰实验以siRNA-539为干扰靶点。

qRT-PCR:实时荧光定量聚合酶链反应;ZFAS1:锌指蛋白反义链1。Control组:空白对照组;siRNA NC组:阴性对照组;siRNA-697组:转染siRNA-697组;siRNA-539组:转染siRNA-539组;siRNA-624组:转染siRNA-624组。与阴性对照组比较,△:P<0.05。

2.7 siRNA敲低lncRNA ZFAS1对肝细胞Col1α1、TGF-β1和MMP-2表达的影响 TGF-β1是公认的致纤维化细胞因子,研究中常用 5 ng/mL TGF-β1 处理细胞 24 h 模拟小鼠肝细胞纤维化模型[15],TGF-β1处理细胞出现明显的梭形或针尖样,类似成纤维样细胞,提示造模成功(图7)。本研究通过Western-blot检测NCTC1469细胞在有、无沉默lncRNA ZFAS1的基础上对TGF-β1诱导后,NCTC1469表达纤维化相关标志蛋白的变化,评估lncRNA ZFAS1表达对LF的影响。与对照组比较,模型组(即TGF-β1处理组)的Col1α1、TGF-β1和MMP-2蛋白的表达水平显著升高,差别有统计学意义(P<0.05),提示TGF-β1处理上调NCTC1469细胞表达纤维化相关标志蛋白Col1α1、TGF-β1和MMP-2;与模型组比较,ZFAS1干扰+模型组NCTC1469细胞表达Col1α1、TGF-β1和MMP-2蛋白显著下降,差别有统计学意义(P<0.05,图8),提示siRNA干扰抑制lncRNA ZFAS1表达后,可有效阻断TGF-β1对肝细胞的促纤维化作用。

Col1α1:Ⅰ型胶原α1;TGF-β1:转化生长因子-β1;MMP-2:基质金属蛋白酶-2;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶;ZFAS1:锌指蛋白反义链1。A组:对照组;B组:模型组+TGF-β1处理组;C组:ZFAS1干扰对照组;D组:ZFAS1干扰对照+模型组;E组:ZFAS1干扰组;F组:ZFAS1干扰+模型组。A:免疫印迹法检测各组Col1α1、TGF-β1和MMP-2蛋白的表达情况;B:半定量分析各组Col1α1、TGF-β1和MMP-2蛋白相对表达量。与对照组比较,△:P<0.05;与模型组比较,▲:P<0.05。

3 讨 论

本研究成功构建了CCl4诱导的小鼠LF模型,探讨了lncRNA ZFAS1与LF发病的关系。与对照组比较,lncRNA ZFAS1在纤维化小鼠肝组织中表达明显升高。进一步构建体外LF细胞模型实验发现,干扰lncRNA ZFAS1后,Col1α1、TGF-β1和MMP-2蛋白的表达水平明显下降,提示lncRNA ZFAS1在LF发展中的潜在作用及抑制ZFAS1后可能对LF具有治疗作用。

LF是肝脏慢性损害的共有病理变化,其关键原因是 HSCs 被激活,HSCs体积增大,并和巨噬细胞等其他非实质细胞一起分泌大量的TGF-β1,同时增加ECM的分泌。另外,激活的HSCs还可转分化为肌成纤维样细胞,这些细胞的细胞质内表达α-SMA和Col1α1等,负责ECM沉积和LF[16-17]。α-SMA 阳性是HSCs活化的标志,而Col1α1是活化HSCs分泌的主要胶原蛋白之一。HYP是胶原的代谢产物,其含量的高低可反映肝组织中胶原含量,是判断LF程度的另一重要指标。由于CCl4诱导的LF模型与人类肝硬化的发病机制类似,且该模型稳定,易于操作,因此笔者采用该模型。本研究结果表明,纤维化小鼠肝组织内炎性细胞浸润明显,胶原纤维沉积明显增多,HYP含量增加,α-SMA和Col1α1的表达也明显升高。

分子研究的最新进展表明,lncRNAs导致多种病理生理机制,并在包括LF在内的许多疾病的发生、发展过程中充当基因表达的重要调节者[7,18-20]。lncRNAs(如miRNAs和lncRNAs)的失调导致HSCs中的基因表达异常[21-22]。lncRNA ZFAS1最初通过上调细胞增殖、迁移和上皮间质转换(epithelial mesenchymal transition, EMT),被鉴定为一种新的肿瘤相关lncRNA[12,23-24]。最近,lncRNA ZFAS1的上调被证明通过促进ZEB2的表达诱导EMT和ECM沉积[25],表明lncRNA ZFAS1可能参与纤维化的进展。本研究还发现,与对照组比较,lncRNA ZFAS1在LF模型小鼠中表达水平明显升高,而抑制体外LF模型的lncRNA ZFAS1后,Col1α1、TGF-β1和MMP-2等蛋白的表达水平明显下降,提示lncRNA ZFAS1可能参与小鼠LF的形成。

然而,关于lncRNA ZFAS1在LF发生、发展中可能的机制目前仍未明确。lncRNA可通过TGF-β信号通路、DNA甲基化和竞争性内源性RNA的调节[5-9]及致死性脂质活性氧(reactive oxygen species, ROS)的异常表达等机制在LF中发生作用[26]。最近,在纤维化相关疾病的组织中还检测到铁死亡生物标志物,如ROS、丙二醛和谷胱甘肽过氧化物酶4,并发现铁负荷可能加重肝脏病理,提示铁死亡可能参与LF的过程[27-30],调节铁死亡信号通路能改善LF和HSCs的活化[27]。而lncRNA ZFAS1可以促进铁死亡[14],提示lncRNA ZFAS1可能通过铁死亡参与LF过程。在后续的研究中,笔者将进一步探索其在LF中的作用机制。