赵 玲 彭 湃 冯沛贝 易善永

肺癌是临床常见的原发性恶性肿瘤,常发于60岁以上男性,其发病率及病死率均居我国恶性肿瘤首位,以发病隐匿、远端转移迅速为主要特征[1]。近年来,铁死亡理论在肿瘤治疗的各项研究中崭露头角,作为肿瘤治疗新方向被众多学者所关注。重楼皂苷是中药重楼主要药理成分之一,具有抑菌、抗炎、抗病毒等多种药理活性[2]。有研究表明[3],其可有效抑制人骨肉瘤U2OS细胞活性、促进自噬及凋亡,从而发挥其抗肿瘤功效。本研究采用重楼皂苷干预人肺癌A549细胞,观察其对该细胞铁死亡的影响,并探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人肺癌A549细胞株,购自中国科学院上海细胞库。

1.2 药物、主要试剂、仪器

重楼皂苷(纯度:98%)、铁死亡诱导剂Erastin(上海源叶生物科技有限公司),c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino terminal kinase,JNK)/p53信号通路抑制剂SP600125[爱必信(上海)生物科技有限公司],丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒、双染细胞凋亡试剂盒(上海抚生实业有限公司),兔抗人溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase 4,GPX4)、JNK、p-JNK、p53一抗(美国CST公司)。

Infinite 200 pro多功能酶标仪(瑞士Tecan公司),IX51倒置荧光显微镜(日本奥林巴斯公司),FACS Aria流式细胞仪(美国BD公司)。

1.3 细胞培养

取A549细胞株恒温37 ℃水浴解冻,在RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清、1%青链霉素)中,培养箱标准条件下(37 ℃,5%CO2)培育,待细胞融合至80%,消化传代培养,取对数期细胞作为后续实验对象。实验均设置5个复孔,取均值。

1.4 细胞分组、处理[4-5]

取对数期A549细胞,清洗、重悬,调整细胞密度为1×106个/mL接种至6孔板,待细胞融合至80%,分为对照组、重楼皂苷组、SP600125组、联合组。对照组完全培养基常规培养,重楼皂苷组培养基加入重楼皂苷(终浓度4 g/L),SP600125组培养基加入SP600125(终浓度10 μmol/L),联合组培养基加入重楼皂苷(4 g/L)及SP600125(10 μmol/L)。取干预48 h后的细胞作为后续实验对象。

1.5 MTT实验检测细胞铁死亡抗性

取干预后各组细胞,PBS重悬,以1×105个/mL接种于96孔板,正常孵育24 h后,加入Erastin剂1 μmol/L诱导铁死亡,24 h后各孔加入新配置MTT溶液(5.00 g/L)100 μL,2 h后吸弃上清,加入150 μL DMSO,振荡10 min后静置,酶标仪检测各孔490 nm位置吸光度值,以各孔吸光度值与对照孔吸光度值之比代表各孔细胞铁死亡相对抗性。

1.6 荧光探针法检测细胞内ROS堆积

取干预后各组细胞,PBS重悬,以1×106个/mL接种至6孔板,将DCFH-DA荧光探针以1∶1 000避光溶解于无血清培养基,每孔各滴加500 μL,培养箱标准条件下继续孵育20 min,吸弃原DCFH-DA荧光探针培养基,PBS清洗3次,加入完全培养基,荧光显微镜观察红色荧光细胞即为ROS阳性细胞,拍照并统计各组视野内阳性细胞数。

1.7 细胞MDA水平检测

取干预后各组细胞,PBS清洗,以1×106个/mL接种至6孔板,低温离心5 min(1000 r/min,r=8 cm)后弃上清,滴加提取液超声碎裂细胞,低温离心10 min(10 000 r/min,r=8 cm)取上清,根据细胞内MDA检测试剂盒说明操作实验步骤,经比色法测定各组细胞MDA水平。

1.8 Western blot法检测细胞铁死亡相关蛋白SLC7A11、GPX4蛋白表达

取干预后的各组细胞,PBS清洗,加入RIPA裂解细胞并注入离心管内,低温离心15 min(10 000 r/min,r=10 cm),取沉淀物经BCA法定量蛋白。取微量待测蛋白,以1∶5体积比与SDS-PAGE上样缓冲液混匀,水浴加热变性蛋白,离心取其上清,恒压80 V电泳分离并湿转至硝酸纤维素膜,加入BSA液封闭2 h,加入兔抗人SLC7A11、GPX4一抗(1∶500),4 ℃冰箱过夜,TBST清洗,加入二抗(1∶2 000)常温孵育2 h,TBST清洗,ECL液发光,暗盒显影,凝胶分析仪分析蛋白条带灰度值,以SLC7A11、GPX4蛋白灰度值与内参GAPDH灰度值比值表示细胞SLC7A11、GPX4相对蛋白表达量。

1.9 流式细胞术检测细胞凋亡率

取干预后的各组细胞,PBS清洗、重悬,以1×106个/mL接种至6孔板,完全培养液标准环境下培养48 h,PBS清洗,低温离心5 min(1000 r/min,r=8 cm)后弃上清,根据细胞凋亡检测试剂盒说明书要求设计并操作实验过程,binding buffer液悬浮细胞,加入5 μL Annexin V-FITC避光染色15 min,再加入5 μL PI液双染,经流式细胞仪检测细胞凋亡情况,计算各组细胞凋亡率。

1.10 Western blot法检测细胞JNK、p-JNK、p53蛋白表达

取干预后的各组细胞,清洗、裂解、离心、定量、电泳、转膜、封闭同1.8,加入兔抗人JNK、p-JNK、p53一抗(1∶500),4 ℃冰箱过夜,TBST清洗,加入二抗(1∶2 000)常温孵育2 h,TBST清洗,ECL液发光,暗盒显影,凝胶分析仪分析蛋白条带灰度值,以JNK、p-JNK、p53蛋白灰度值与内参GAPDH灰度值比值表示细胞JNK、p-JNK、p53相对蛋白表达量,计算p-JNK/JNK。

1.11 统计学处理

2 结果

2.1 细胞铁死亡抗性比较

与对照组比较,重楼皂苷组铁死亡抗性降低(P<0.05),SP600125组铁死亡抗性升高(P<0.05);与重楼皂苷组比较,联合组铁死亡抗性升高(P<0.05);与SP600125组比较,联合组铁死亡抗性降低(P<0.05),见表1。

表1 各组细胞铁死亡抗性比较

2.2 细胞内ROS堆积比较

与对照组比较,重楼皂苷组ROS阳性细胞数增加(P<0.05),SP600125组ROS阳性细胞数减少(P<0.05);与重楼皂苷组比较,联合组ROS阳性细胞数减少(P<0.05);与SP600125组比较,联合组ROS阳性细胞数增加(P<0.05),见表2。

表2 各组ROS阳性细胞数比较个)

2.3 细胞内MDA水平比较

与对照组比较,重楼皂苷组细胞内MDA水平升高(P<0.05),SP600125组细胞内MDA水平降低(P<0.05);与重楼皂苷组比较,联合组细胞内MDA水平降低(P<0.05);与SP600125组比较,联合组细胞内MDA水平升高(P<0.05)。见表3。

2.4 各组细胞铁死亡相关蛋白SLC7A11、GPX4蛋白表达比较

与对照组比较,重楼皂苷组SLC7A11、GPX4蛋白表达降低(P<0.05),SP600125组SLC7A11、GPX4蛋白表达升高(P<0.05);与重楼皂苷组比较,联合组SLC7A11、GPX4蛋白表达升高(P<0.05);与SP600125组比较,联合组SLC7A11、GPX4蛋白表达降低(P<0.05)。见表4,图1。

表4 各组细胞铁死亡相关蛋白SLC7A11、GPX4蛋白表达比较

2.5 各组细胞凋亡率比较

与对照组比较,重楼皂苷组细胞凋亡率升高(P<0.05),SP600125组细胞凋亡率降低(P<0.05);与重楼皂苷组比较,联合组细胞凋亡率降低(P<0.05);与SP600125组比较,联合组细胞凋亡率升高(P<0.05)。见表5,图2。

图1 细胞SLC7A11、GPX4蛋白表达

表5 各组细胞凋亡率比较

图2 细胞凋亡流式图

2.6 各组细胞p-JNK/JNK及p53蛋白表达比较

与对照组比较,重楼皂苷组p-JNK/JNK及p53蛋白表达升高(P<0.05),SP600125组p-JNK/JNK及p53蛋白表达降低(P<0.05);与重楼皂苷组比较,联合组p-JNK/JNK及p53蛋白表达降低(P<0.05);与SP600125组比较,联合组p-JNK/JNK及p53蛋白表达升高(P<0.05)。见表6,图3。

3 讨论

肺癌是源自支气管黏膜上皮的一种呼吸道癌症,右肺上叶是最常见发病位置,可沿支气管壁向外扩张,逐步占领周围肺组织,后浸润至胸膜外部,通过淋巴及血液转移至其他脏器[6]。肺癌的早期症状并不明显,常表现为咳嗽、痰中带血、低热、胸部胀痛等典型呼吸系统疾病症状,后期则表现为颈部水肿、声音嘶哑及呼吸困难,多伴随异位激素分泌综合征,且根据远端转移脏器的不同,伴发阻塞性肺炎、腰痛、心包积液甚至脑皮质变性[7]。吸烟是肺癌发病的首要危险因素,其因素亦包括粉尘环境、电离辐射、慢性呼吸道疾病等。铁死亡是近年来新发现的一种细胞死亡模式,因细胞摄入铁离子增多,铁离子被转化为亚铁离子,同时使细胞内大量生成脂质ROS,氧化应激反应加剧,造成脂质过氧化物如MDA堆积,从而导致细胞死亡,肺癌细胞长期处于高氧环境下,且需要吸收更多铁离子以提高自身增殖性,以致其对铁死亡尤为敏感[8]。因此,诱导肺癌细胞铁死亡或可成为肺癌化疗耐受患者新的治疗方式。

表6 各组细胞p-JNK/JNK及p53蛋白表达比较

图3 细胞p-JNK、JNK、p53蛋白表达

SLC7A11属于溶质载体家族,是铁死亡重要的调控因子,作为细胞膜重要的氨基酸转运体,可等量比例排出细胞内谷氨酸并输入胱氨酸[9]。GPX4是细胞内重要的促还原酶,可促进胱氨酸合成还原剂谷胱甘肽,从而抑制细胞内氧化应激反应,抑制细胞铁死亡[10]。中医将肺癌归为“肺岩”、“痞癖”、“胸痛”等症范畴,其主要病机为正气不足、邪气踞之,肺为娇脏,不耐六淫,客邪留滞于肺,蕴积生热、气阴两虚,肺失宣降、津血凝滞、痰瘀内生,热毒痰瘀搏结,积聚成癌,故治疗应以清热解毒、化瘀通络为主[11]。中药重楼取自百合科重楼属植物华重楼、云南重楼及七叶一枝花干燥根茎,性微寒、味苦、微毒,归肝经,可祛毒、清热,治疔疮癌肿,明代药学家兰茂言其可攻各种疮毒痈疽,主治一切无名肿毒[12]。重楼皂苷是提取自重楼根茎内的一种甾体皂苷,可促进内质网应激反应、停滞肿瘤细胞周期并抑制血管新生,从而发挥其抑癌功效。Zhou等[13]研究认为,重楼皂苷可增强三阴性乳腺癌细胞铁敏感,诱导其铁死亡,提示其或可成为恶性肿瘤诱导铁死亡治疗的新药物。本研究结果显示,与对照组比较,重楼皂苷组铁死亡抗性,SLC7A11、GPX4蛋白表达降低,ROS阳性细胞数增加,细胞内MDA水平、细胞凋亡率升高,提示重楼皂苷可促进肺癌细胞氧化应激反应及细胞凋亡,诱导铁死亡。

JNK是丝裂原活化蛋白激酶家族重要成员,在细胞生长、分化、凋亡、氧化应激、线粒体功能异常及内质网应激等病理生理过程中发挥重要作用[14]。p53是JNK通路下游重要的抑癌因子,参与细胞周期调节、DNA损伤修复、细胞死亡等多个细胞过程,可下调铁死亡相关因子SLC7A11表达,诱导高氧环境肺癌细胞铁死亡[15]。王俊岩等[16]研究认为,抑制JNK/p53通路可抑制心肌细胞铁死亡,进而改善慢性心衰小鼠心功能,提示JNK/p53通路在细胞铁死亡方面的作用。本研究结果显示,与对照组比较,重楼皂苷组p-JNK/JNK及p53蛋白表达升高,且在重楼皂苷基础上增用JNK/p53通路抑制剂SP600125可减弱重楼皂苷对肺癌的治疗作用,提示重楼皂苷可能通过介导该通路诱导肺癌细胞铁死亡。

综上所述,重楼皂苷可促进肺癌细胞氧化应激反应及细胞凋亡,诱导其铁死亡,其作用机制可能与激活JNK/p53信号通路有关。