纪晨雪,牛永武,杨岩晓,乔 杉,赵仁勇

河南工业大学 粮油食品学院,河南 郑州 450001

脂肪酶(triacylglycerol acylhydrolases, ES 3.1.1.3)能够催化甘油三酯水解,生成甘油二酯、单甘酯和脂肪酸[1],酶水解具有反应高效、无须辅酶参与、副反应少等优点。随着研究的持续深入,脂肪酶的应用领域不断拓宽。目前,脂肪酶已在食品生产[2]、生物柴油[3]、日化洗涤[4]、医疗制药[5]等领域得到广泛应用。我国开展脂肪酶相关研究时间相对较晚[6],虽然当前研究的脂肪酶种类较多,但工业化生产种类有限。因此,表征具有工业化生产价值的脂肪酶相关酶学性质对发掘脂肪酶的应用潜力具有重要意义。

不同微生物来源脂肪酶的酶学性质具有显著差异性,直接决定其应用范围。Gu等[7]发现Microbulbifersp. YNDZ01合成脂肪酶在70 ℃和pH 10条件下表现出最高的催化活性,对多种有机溶剂和洗涤剂具有一定的耐受性,对中、短链三酰基甘油和对硝基苯酚酯均具有水解能力,表明该脂肪酶作为一种非水相生物催化剂具有一定的应用前景。Gurkok等[8]对Aeromonascaviae合成的胞外脂肪酶进行性质研究,发现脂肪酶在25～70 ℃、pH 6～11范围内均有较好的催化活性,Ba2+、Ca2+、Co2+、Cu2+、Fe3+、Mg2+对脂肪酶活性具有激活作用,而Mn2+、Mo2+、Ni2+、Zn2+具有抑制酶活力的效果,将该脂肪酶与洗衣粉配合使用,可以增强洗涤性能,提高去污能力。Kumar等[9]发现ChryseobacteriumpolytrichastriERMR1∶04合成的脂肪酶在5～65 ℃范围内具有一定的催化活性,Na2+、K+、Ca2+、Mg2+、Mn2+能够提高脂肪酶活性,Cu2+、Fe2+则降低脂肪酶活性,并且它对甲醇和异丙醇具有很好的耐受性。该脂肪酶与普通商业洗涤剂具有良好的生物兼容性,是一种潜在的洗涤剂配方。总的来看,研究人员已经针对多种微生物脂肪酶的最适反应温度、pH值、金属离子耐受性和有机溶剂耐受性等酶学性质进行了研究,不同脂肪酶的性质各有不同[4]。因此,对新发掘脂肪酶的酶学性质进行研究具有必要性。

蚜虫莫氏黑粉菌(Moesziomycesaphidis,M.aphidis)是一种能够在仅以植物油为碳源的培养基中生长繁殖,高效合成甘露糖赤藓糖醇脂(MELs)的菌株[10]。关于M.aphidis的相关研究主要围绕MELs的合成、代谢调控及产物应用展开[11-12]。本实验室前期研究发现M.aphidis可以合成脂肪酶,优化后的脂肪酶活性较高,具有一定的工业化应用潜力。Dimitrijevic等[13]对M.aphidis合成粗脂肪酶活力和5种有机溶剂耐受性也有研究报道,发现在丙酮和乙腈中粗脂肪酶对对硝基苯酚棕榈酸酯(p-NPP)表现出较好的水解活性,但未对最适温度、pH值等酶学性质进行全面研究。基于此,作者对M.aphidis生物合成的脂肪酶进行相关酶学性质研究,明确其最适反应温度和温度稳定性、最适反应pH值和pH稳定性,以及金属离子、表面活性剂和有机溶剂对脂肪酶活性的影响,并测定作用底物位置特异性和酶促反应动力学,为推动该脂肪酶的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

蚜虫莫氏黑粉菌(Moesziomycesaphidis,M.aphidis),本实验室保藏。

1.1.2 培养基

活化培养基：酵母浸粉3.0 g,麦芽浸粉3.0 g,葡萄糖10.0 g,蛋白胨5.0 g,去离子水1.0 L。

发酵培养基：NaNO33.1 g,MgSO4·7H2O 0.4 g,KH2PO40.3 g,酵母浸粉2.24 g,葡萄糖50.0 g,吐温-80 3.0 mL,去离子水1.0 L,初始pH未调节。配制后,分装入250 mL锥形瓶中,每瓶装液量为30.0 mL,加入花生油2.0%(体积分数,下同),121 ℃灭菌15 min,备用。

1.1.3 试剂

葡萄糖、(NH4)2SO4、CaSO4、MgSO4、无水乙醇、甲苯、正己烷、乙二胺四乙酸(EDTA)：天津市科密欧化学试剂有限公司;蛋白胨：生化级,北京奥博星生物试剂有限公司;ZnSO4、Fe2(SO4)3、KH2PO4：天津市恒兴化学试剂制造有限公司;阿拉伯胶：迈瑞尔生物试剂有限公司;吐温-20、曲拉通-100：化学纯,天津市光复精细化工有限公司;酵母浸粉：化学纯,安琪酵母股份有限公司;CuSO4：西陇化工股份有限公司;吐温-80：化学纯,天津市凯通化学试剂有限公司;磷酸：洛阳昊华化学试剂有限公司;异丙醇：天津市东力化学试剂有限公司;三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)：北京索莱宝科技有限公司;对硝基苯酚(PNP)、p-NPP：阿拉丁生化科技股份有限公司;考马斯亮蓝G250：北京鼎国昌盛生物技术有限公司;咪唑啉：上海麦克林生化科技有限公司;十二烷基磺酸钠(SDS)、甘油、二甲基亚砜(DMSO)：国药集团化学试剂有限公司;氯仿、正己烷：天津赛孚瑞科技有限公司。上述试剂无特别说明均为分析纯。

1.2 仪器与设备

PL1502-S分析天平：瑞士Mettler Toledo公司;ZHJH-C1109C超净工作台：上海智城分析仪器制造有限公司;YXQ-LS立式压力蒸汽灭菌锅：上海博讯实业有限公司;Vortex-2 Genie涡旋振荡器：美国Scientific Industries公司;SevenEasy S20 pH计：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;5424高速离心机：德国Eppendorf公司;UV-2550紫外分光光度计：日本岛津公司;HH-4数显恒温水浴锅：上海华燕医疗器械有限公司;ZQZY-C8振荡培养箱：上海知楚仪器有限公司;SPARK酶标仪：澳大利亚Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酶的制备

从-80 ℃冰箱中取出25.0%甘油保存的菌株,35～37 ℃孵育1～2 min解冻,按照2.0%(V/V)接种活化培养基中(50.0 mL/250 mL锥形瓶),28 ℃、180 r/min培养48 h得活化液。将活化液按照2.0%(V/V)接种到发酵培养基中,25.8 ℃、180 r/min培养7 d,获得发酵液。发酵液在12 000 r/min条件下离心5 min,收集上清液,即为粗脂肪酶液,用于后续的酶学性质研究。

1.3.2 蛋白含量的测定

以牛血清蛋白为标准,采用Bradford法测定上清液中的蛋白含量[14]。

1.3.3 脂肪酶酶活的测定

以对硝基苯酚棕榈酸酯(p-NPP)为底物,根据曹茜[15]使用的方法,结合实验室前期关于酶活测定方法的研究结果,确定脂肪酶酶活的测定方法：在2.0 mL离心管中加入600.0 μLp-NPP溶液,同时加入适当稀释的粗酶液25.0 μL,空白对照加入等量0.05 mmol/L Tris-HCl pH 8缓冲液,70 ℃水浴反应10 min,500.0 μL无水乙醇终止反应。12 000 r/min条件下离心5 min,在410.0 nm处测定吸光度。

1 min催化水解底物p-NPP生成1 μmol对硝基苯酚(PNP)所需酶量为1个酶活单位(U)。比酶活的定义为单位质量蛋白所具有的酶活力(U/mg)。

1.3.4 pH值对脂肪酶活性和稳定性的影响

分别配制pH 5、6、7、8、9、10的Tris-HCl缓冲液,测定酶活,确定脂肪酶的最适反应pH值。将酶液加入不同pH值5～10的Tris-HCl缓冲液中混匀,在4 ℃下孵育1 h,测定酶活。根据相对酶活评价脂肪酶的pH稳定性。

1.3.5 温度对脂肪酶活性和稳定性的影响

将25.0 μL适当浓度的脂肪酶液与600.0 μL底物混合均匀,然后置于不同温度(40、50、60、70、80、90 ℃)水浴中反应后测定酶活,确定脂肪酶的最适反应温度。探究脂肪酶的温度稳定性,先将酶液置于-20、4、25、50、70、90 ℃孵育1～5 h,再放置于70 ℃水浴中反应10 min后测定酶活。

1.3.6 金属离子对脂肪酶活性的影响

配制1.0、5.0、10.0 mmol/L的Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Mg2+溶液,其中阴离子均为SO42-,分别与脂肪酶液混合均匀,4 ℃下孵育1 h,测定酶活。

1.3.7 表面活性剂及抑制剂对脂肪酶活性的影响

配制0.05%(V/V)吐温-20、吐温-80、曲拉通-100、咪唑啉等表面活性剂溶液和1 mmol/L SDS、阿拉伯胶、EDTA溶液,分别与脂肪酶液混合均匀,4 ℃下孵育1 h,测定酶活。

1.3.8 有机溶剂对脂肪酶活性的影响

选择甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丙酮、DMSO、苯、甲苯、乙醚、氯仿等工业常用有机溶剂,配制体积分数为30%的溶液,分别与脂肪酶液混合均匀,4 ℃下孵育1 h,测定酶活。

1.3.9 相对酶活计算

所有测定pH(或温度)的最高酶活为对照(相对酶活为100%),计算不同测定pH(或温度)条件下的相对酶活。其中,相对酶活为不同pH(或温度)下的酶活与测定pH(或温度)下的最高酶活的比值。

其他酶学性质探究中均以未处理的粗脂肪酶液酶活为对照(相对酶活为100%),计算各处理条件下的相对酶活。其中,相对酶活为各处理条件下的酶活与未处理条件下酶活的比值。

1.3.10 脂肪酶水解位置特异性测定

参照刘光[16]使用的方法并稍做修改。具体方法：将1 mL三油酸甘油酯、2 mL Tris-HCl缓冲液、1 mL脂肪酶液在15 mL带盖离心管中混匀,50 ℃、200 r/min振荡反应1 h,加入2 mL乙醚萃取水解产物,12 000 r/min离心5 min,取上层液进行薄层色谱分析。展开剂体系为正己烷-乙醚-甲酸(体积比为70∶30∶1),碘熏蒸显色。将三油酸甘油酯、1,3-二油酸甘油酯、1,2-二油酸甘油酯标准品用正己烷溶解后作为参照。

1.3.11 酶促反应动力学

分别配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mmol/L的p-NPP溶液,按照1.3.3的方法测定酶活,以p-NPP浓度的倒数为横坐标,酶活的倒数为纵坐标作Lineweaver-Burk图,测定脂肪酶水解p-NPP的米氏常数Km和最大反应速率vmax。

1.4 数据分析

无特殊说明,本试验所有数据均为3次试验结果的平均值,使用平均值±标准差表示,采用Orign 8.5进行绘图,采用SPSS 20.0进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 粗脂肪酶液的酶活和蛋白含量

利用M.aphidis发酵合成脂肪酶,离心去除菌体后得到粗脂肪酶液,其酶活为99.01 U/mL,蛋白含量为280.00 mg/L,比酶活为353.59 U/mg,比文献[13]报道的最高酶活(35 U/mL)提高了64.01 U/mL。将此粗脂肪酶液用于后续的酶学性质研究。

2.2 pH值对脂肪酶活性和稳定性的影响

注：同一条折线上的不同字母表示数据间存在显著性差异(P<0.05)。图2、图3同。图1 pH值对脂肪酶活性和稳定性的影响Fig.1 Effect of pH on lipase activity and stability

pH值对脂肪酶活性和稳定性的影响见图1。由图1可以看出,脂肪酶的相对酶活随着缓冲液pH值的增大呈现出先增加后降低的趋势,在pH 8时脂肪酶表现出最大活性,相对酶活为100%,表明M.aphidis所产脂肪酶的最适反应pH值为8。pH 5～6时脂肪酶酶活显著降低,相对酶活不到1%,在pH 9～10时相对酶活保持在60%以上。研究表明,脂肪酶分子活性中心受到酸性环境的影响,导致部分基团解离受阻,影响脂肪酶与底物结合,反应速率降低,导致酶活减小[17],多数微生物脂肪酶的最适反应pH偏碱性[8,18-19]。以最适反应pH 8为基础,分别测定不同pH值处理后的脂肪酶酶活,并计算出各相对酶活。分析M.aphidis所产脂肪酶的pH稳定性,发现不同pH值处理后的脂肪酶相对酶活差别较小,说明脂肪酶在pH 5～10范围内具有一定的酸碱稳定性,有利于储藏和实际应用。因此,M.aphidis所产脂肪酶更适合应用于碱性环境中,属于耐碱性脂肪酶。

2.3 温度对脂肪酶活性和稳定性的影响

温度对脂肪酶活性的影响见图2。由图2可知,40～90 ℃范围内,相对酶活随着温度的升高呈现先增大后减小的趋势,在70 ℃时表现出最大的催化活性,此时相对酶活为100%,表明M.aphidis所产脂肪酶的最适反应温度为70 ℃。当温度为80 ℃和90 ℃时,相对酶活逐渐降低,但仍保留70%以上的相对活性,表明脂肪酶具有一定的耐高温特性。温度升高可以提升反应体系活化能,使底物与脂肪酶之间有效碰撞增加,有利于酶活力提高。但温度过高时,脂肪酶发生变性,酶活降低。

图2 温度对脂肪酶活性的影响Fig.2 Effect of temperature on lipase activity

温度对脂肪酶稳定性的影响见图3。由图3可知,-20～70 ℃下处理1～5 h的脂肪酶相对酶活均高于75%,表明其具有良好的热稳定性。70 ℃下处理1～4 h后相对酶活保持在80%以上,表明该脂肪酶具有耐高温特性。90 ℃处理1 h后,相对酶活接近0%,时间延长后完全失活,表明该酶不能耐受90 ℃的高温。说明M.aphidis所产脂肪酶能够在较高反应温度条件下进行应用。

图3 温度对脂肪酶稳定性的影响Fig.3 Effect of temperature on the stability of lipase

2.4 金属离子对脂肪酶活性的影响

金属离子对脂肪酶活性的影响见表1。由表1可以看出：Mn2+和Mg2+不同浓度下的脂肪酶相对酶活差别不大;随着Ca2+浓度的升高,相对酶活逐渐增大;0.1、10 mmol/L Cu2+对脂肪酶的相对酶活具有显著的抑制作用;随着Fe2+、Fe3+、Zn2+浓度的升高,脂肪酶相对酶活逐渐降低,其中10 mmol/L Zn2+抑制作用最大,此时的相对酶活仅为3.81%±0.33%。因此,M.aphidis所产脂肪酶的实际应用中应该减少Ca2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+等金属离子的浓度,且避免Zn2+的存在。

表1 金属离子对脂肪酶活性的影响Table 1 Effects of metal ions on lipase activity

2.5 表面活性剂及抑制剂对脂肪酶活性的影响

吐温-20、吐温-80、阿拉伯胶等表面活性剂可以通过改变脂肪酶的三维构象来影响酶活[20]。EDTA常作为蛋白酶抑制剂与金属酶类分子中的金属离子发生螯合作用,改变酶分子构象从而抑制酶活。表面活性剂和抑制剂对脂肪酶活性的影响见图4。由图4可以看出,吐温-20、吐温-80、曲拉通-100和SDS均能明显提高相对酶活,其中曲拉通-100的促进作用最显著,相对酶活达152.36%±1.66%。阿拉伯胶和咪唑啉存在条件下,脂肪酶相对酶活受到显著抑制,其中咪唑啉对脂肪酶活抑制作用最强,相对酶活仅为39.15%±1.95%。抑制剂EDTA对酶活无显著的促进或抑制作用,说明M.aphidis所产脂肪酶不属于金属酶类,这与各种金属离子的作用结果具有一致性。因此,M.aphidis所产脂肪酶在应用中需要注意表面活性剂种类的选择。

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图4 表面活性剂及抑制剂对脂肪酶活性的影响Fig.4 Effects of surfactants and inhibitors on lipase activity

2.6 有机溶剂对脂肪酶活性的影响

有机溶剂可以改变脂肪酶的构象,从而影响脂肪酶的功能和催化活性,大部分醇类对多数微生物脂肪酶活力具有促进作用。从表2可以看出,甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丙酮、DMSO等亲水性有机溶剂对脂肪酶表现出一定的激活作用,其中,30%异丙醇可以将脂肪酶的相对酶活提高约30%。可能是因为脂肪酶分子表面结构亲水,极性较大的亲水性有机溶剂能够促进酶与底物的结合[8,20]。在疏水性有机溶剂中,苯、甲苯、乙醚、正己烷能够显著提高脂肪酶催化活性,而脂肪酶在氯仿中孵育1 h后的相对酶活下降了约46%,呈现出明显的抑制作用。因此,M.aphidis所产脂肪酶对工业生产中多种常用有机溶剂具有良好的耐受性。

2.7 位置特异性测定

不同来源脂肪酶水解三油酸甘油酯的作用位点有所差异,常见的为sn-1,3专一性脂肪酶,仅作用于三油酸甘油酯的1位和3位酯键发生水解反应[7,20]。sn-2的位置特异性脂肪酶较少,主要原因是2位酯键的空间位阻较大,结合困难,不易发生水解反应。薄层色谱分析M.aphidis所产脂肪酶作用三油酸甘油酯的水解产物,结果见图5,水解反应产物中同时出现了1,3-二油酸甘油酯和1,2-二油酸甘油酯,并且含量相近,说明M.aphidis所产脂肪酶水解三油酸甘油酯无位置特异性,催化效率较高。

表2 有机溶剂对脂肪酶活性的影响Table 2 Effects of organic solvents on lipase activity

a.三油酸甘油酯标准品;b.1,3-二油酸甘油酯标准品;c.1,2-二油酸甘油酯标准品;d.三油酸甘油酯的水解产物图5 脂肪酶水解三油酸甘油酯反应产物的薄层色谱Fig.5 Thin layer chromatogram of the reaction product of lipase hydrolysis of triglycerides

2.8 酶促反应动力学

酶促反应动力学中米氏常数Km和最大反应速率vmax与脂肪酶种类以及作用底物有关,Km越小,vmax越大,表示酶与底物结合能力越强,反应越快[21]。以p-NPP为作用底物研究M.aphidis同源性菌株——黑曲霉合成脂肪酶的酶促动力学报道中,舒正玉等[22]表征AspergillusnigerF044合成脂肪酶的米氏常数Km为7.37 mmol/L,刘光[16]报道黑曲霉合成脂肪酶米氏常数Km为10 μmol/L,Romero等[23]研究黑曲霉MYA135合成脂肪酶的米氏常数Km为2.81 mmol/L。Osuna等[21]对Aspergillusniger合成脂肪酶的米氏常数Km为27.2 mmol/L。由图6可知,M.aphidis所产脂肪酶水解p-NPP的米氏常数Km为1.14 mmol/L,显著小于上述报道的黑曲霉脂肪酶水解p-NPP的米氏常数,此时M.aphidis所产脂肪酶的最大反应速率vmax为119.05 mol/min,说明M.aphidis所产脂肪酶与底物p-NPP具有更强的结合能力。

图6 脂肪酶水解p-NPP的Lineweaver-Burk图Fig.6 Lineweaver-Burk plot of p-NPP hydrolysis by lipase

3 结论

对蚜虫莫氏黑粉菌发酵合成的脂肪酶进行酶学性质表征,明确了脂肪酶的最适反应温度为70 ℃,pH值为8。Mg2+对脂肪酶酶活促进作用并不显著,Ca2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+等金属离子对脂肪酶活力具有一定的抑制作用,其中Zn2+抑制效果最为显著。吐温-20、吐温-80、曲拉通-100、SDS、阿拉伯胶等表面活性剂对脂肪酶活力具有显著的促进作用。甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丙酮、DMSO、苯、甲苯、乙醚、正己烷等大部分亲水性和疏水性有机溶剂对脂肪酶活力具有促进激活的效果,但氯仿对脂肪酶酶活起到抑制作用。脂肪酶能够同时水解三油酸甘油酯的1,3位和2位酯键,没有水解位点特异性。同时,发现脂肪酶水解p-NPP的米氏常数Km为1.14 mmol/L,最大反应速率vmax为119.05 mol/min。

与已报道的微生物脂肪酶相比,M.aphidis所产脂肪酶在-20～70 ℃条件下孵育5 h后能够保持较高的催化活性,在酸性和碱性环境下保持良好的稳定性,是一种性质稳定的耐高温碱性脂肪酶。该脂肪酶水解三油酸甘油酯时无位置特异性,能够同时水解多个酯键,水解效率高,在高温、碱性和有机溶剂等环境条件下具有良好的应用前景和开发价值。