梁浩，杜晓静,钱玺丞，贾长青，郁建生

（铜仁职业技术学院国家民委中兽药重点开放实验室，贵州 铜仁 554300）

茶树是我国南方地区重要的经济作物之一[1]，因其口感独特和保健作用，深受广大消费者青睐。由于茶农依赖化学农药防治茶树病虫害，极易造成农药残留超标。农药残留已成为我国茶叶出口欧盟的技术性壁垒[2]，寻找高效低残留无公害农药防治茶树病虫害至关重要。

茶轮斑病和炭疽病是贵州茶区发病范围较广的重要病害，因缺乏安全有效的防控措施，严重影响着茶树生长和翌年春茶产量[3-4]。目前防治这两种病害的生物农药较少，主要通过化学药剂防治。化学农药长期使用不仅污染环境，还会产生抗性问题。为确保茶叶的品质和安全，筛选出高效安全低毒的农药迫在眉睫[5-6]。

近年来，植物源农药因其低毒、低残留和多靶标等特点成为研究热点。作为一种低成本高效的植物源农药，博落回生物碱在防治多种农作物病虫害方面表现出了良好的杀虫和抑菌活性[7]。茶皂素作为一种植物源农药，虽然自身抑菌活性不高，但研究表明其对多种农药都表现出了较好的增效作用，通过与其他农药复配，可大大减少农药的用量[8-10]。

据此，本研究测定了博落回生物碱和茶皂素2种单剂及其不同比例的混和剂对茶轮斑病菌和茶炭疽病菌的室内毒力以及增效作用，旨在为茶皂素和博落回生物碱对这两种病害的田间防治提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 菌种

茶轮斑病和茶炭疽病均分离于正大现代高效茶叶示范园区，经上海生工生物工程技术服务有限公司鉴定。

1.2 主要材料与试剂

博落回生物碱（纯度为76%），参照文献[11]自制；茶皂素（65%；上海源叶生物科技有限公司）；葡萄糖、琼脂粉等其他试剂为市售分析纯试剂。

1.3 主要仪器与设备

超声波清洗机（KQ800E，昆山市超声仪器有限公司）；紫外可见分光光度计（T10CS，北京普析通用仪器有限责任公司）；超净工作台（SW-CJ-2FD，苏州净化工作台设备有限公司）；立式压力蒸汽灭菌器（YM50，上海三申医疗器械有限公司）；恒温恒湿箱（HWS450B，杭州绿博仪器有限公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 室内离体活性测试 用无菌水将2 种药剂配置成100 μg·mL-1的溶液。采用菌落直径法。在含药PDA 培养基平板中央分别接供试菌种的新鲜菌丝块菌碟，菌丝朝下（每个处理设3 个重复）。将含药接菌的培养皿放置于25 ℃恒温恒湿箱中培养，定期观察，采用十字交叉法测菌落直径，计算抑菌率。

1.4.2 博落回生物碱与茶皂素对两种病原菌的EC50值 测定博落回生物碱与茶皂素对2 种植物病原菌的EC50值时，采用菌落直径法，设置5 个浓度梯度，计算各个浓度下对2 种植物病原菌的抑制率，通过计算，得出测定博落回生物碱与茶皂素对2 种植物病原菌的EC50值。

1.4.3 博落回生物碱与茶皂素最佳配比筛选 采用Horsfal 方法[12-13]进行混配比例设计，以博落回生物碱与茶皂素2 种单剂的的EC50为基础浓度，将2 种药剂EC50药液按照体积比和空白对照共设置12 个处理进行测定（100∶0、90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80、10∶90、0∶100、0∶0），见表1。每处理3 个重复，采用十字交叉法参照1.4.1 计算各配比抑制率，再根据以下公式计算毒性比率（毒性比率＞1.25 为增效；毒性比率＜0.75 为拮抗；0.75≤毒性比率≤1.25 为相加）。在此基础上，初步筛选出最佳配比。

表1 各处理博落回生物碱与茶皂素EC50 值剂量百分比

1.4.4 最佳配比联合毒力测定 采用Wadley 法[14]定量筛选，根据初步筛选出的最佳配比（1.4.3 试验结果），将有增效作用的体积配比进行混合测定联合毒力并计算混剂的增效系数SR（SR＞1.5 为增效，0.5≤SR≤1.5 为相加，SR＜0.5 为拮抗），评价复配剂增效比。

式中，EC50(ob)(A)、EC50(ob)(B)分别代表混剂中博落回生物碱和茶皂素的EC50实测值；EC50(ob)（实测值）、EC50(th)（理论值）；a（博落回生物碱的百分含量%）、b（茶皂素在混剂中的百分含量%）；SR 代表增效系数。

1.4.5 数据分析 采用orgin 9.1 软件对数据进行统计，计算各处理平均菌落直径和平均抑制率；采用IBM SPSS Statistics 26 软件对药剂浓度对数值及对应的菌丝生长抑制率几率值进行回归分析，求出各单剂及其不同配比混剂的毒力回归方程、相关系数r 和EC50值。

2 结果与分析

2.1 室内离体活性测试

抑菌活性测定结果表明（表2），博落回生物碱对茶轮斑病和茶炭疽病均表现出了较好的抑菌活性，其中，对茶轮斑病的抑菌活性高于同浓度的多菌灵和吡唑醚菌酯。

表2 博落回生物碱与茶皂素对2 种病原菌离体活性测试100（μg·mL-1）

2.2 博落回生物碱与茶皂素对2 种病原菌的EC50 值

由表3 可知，博落回生物碱对2 种茶树病原菌均有较好的抑菌活性，EC50值分别为6.219、51.674 μg·mL-1；茶皂素对2 种病原菌的抑菌活性较差，EC50值分别为416.435、453.925 μg·mL-1。

表3 博落回生物碱与茶皂素对2 种植物病原菌EC50 值

2.3 博落回生物碱与茶皂素最佳配比筛选

以单剂博落回生物碱与茶皂素的近似EC50值为基础，采用采用交互测定法进行最佳配比的筛选。试验结果表明（表4），在所选配比中，博落回生物碱与茶皂素EC50体积比90∶10、80∶20、60∶40、50∶50、30∶70、20∶80、10∶90 对茶轮斑病菌的毒性比率分别为1.07、1.08、1.15、1.15、1.13、1.17、1.11，表现为相加作用，当博落回生物碱与茶皂素EC50值剂量比例为70∶30、40∶60 时，对茶轮斑病菌的毒性比率分别为1.32、1.41，表现为增效作用；当博落回生物碱与茶皂素EC50体积比90∶10、80∶20、10∶90 对茶炭疽病菌的毒性比率分别为0.98、1.20、1.21，表现为相加作用，当博落回生物碱与茶皂素EC50值体积比为70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80 时，对茶炭疽菌的毒性比率分别为1.29、1.39、1.52、1.64、1.70、1.67，表现为增效作用。综合以上结果，对茶轮斑病菌分别取博落回生物碱与茶皂素EC50值体积比70:30、40:60，对茶炭疽菌分别取博落回生物碱与茶皂素EC50值体积比70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80 作联合毒力验证。

表4 博落回生物碱与茶皂素不同比例混剂对2 种病原菌的毒性比率

2.4 最佳配比联合毒力测定

结合2 个单剂的EC50值，根据Wadley 法计算博落回生物碱与茶皂素不同比例混剂理论上的EC50(th)，并与实际观察的EC50(ob)比较，计算增效系数(SR)。由表5 可知，博落回生物碱与茶皂素EC50值剂量比例40∶60 配比混剂对茶轮斑病菌的增效系数为1.095，均介于0.5～1.5 之间，表现为相加作用，比例40∶60 配比混剂对茶轮斑病菌的增效系数为1.545，大于1.5，表现为增效作用。博落回生物碱与茶皂素EC50值剂量比例30∶70、20∶80 配比混剂对茶炭疽病菌的增效系数为1.181、0.616，均介于0.5～1.5 之间，表现为相加作用，比例70∶30、60∶40、50∶50、40∶60 配比混剂对茶炭疽病菌的增效系数为2.698、2.345、2.974、1.533，均大于1.5，表现为增效作用。

表5 博落回生物碱与茶皂素不同比例混剂对2 种病原菌的联合毒力

3 讨论与结论

研究表明，农药合理混配不但可以延缓药剂抗性的发生和发展，亦可扩大防治谱，提高防效，降低单位面积内的用药, 将不同作用机理的杀菌剂复配表现出优于单剂的防治效果，极大地促进了复配杀菌剂的快速发展[15-16]。目前博落回生物碱对茶树病害活性研究方面主要集中在对茶树虫害的防治，对茶树病害的防治较少[17-19]。茶皂素对茶轮斑病、茶白星病和茶炭疽病均有一定的防治效果[20]，最近国内外不少学者报道了茶皂素对农药的增效作用[21]，茶皂素与山苍籽油、代森锰锌和多菌灵复配，对茶叶炭疽病和轮斑病显示出明显的增效作用[22-23]。

本试验研究了博落回生物碱与茶皂素单剂和复配对茶轮斑病菌和茶炭疽病菌的抑菌活性，结果表明博落回生物碱对茶树轮斑病和茶树炭疽病的EC50分别为6.219、51.674 μg·mL-1；茶皂素对茶树轮斑病和茶树炭疽病的EC50分别为416.435、453.925 μg·mL-1；通过毒性比率筛选和联合毒力测定，确定了博落回生物碱与茶皂素对2 种病原菌的最佳抑菌配比。针对茶轮斑病菌，博落回生物碱与茶皂素EC50值剂量比例为70∶30（质量比为1∶28.7）的增效系数最大，可作为最佳配比；针对茶炭疽病菌，博落回生物碱与茶皂素EC50值剂量比例为50∶50（质量比为1∶8.8）的增效系数同样最大，但该配比混剂中博落回生物碱的实际含量明显高于70∶30、60∶40 配比；从降低农药使用成本等方面考虑，茶皂素价格远低于博落回生物碱，因此选择博落回生物碱与茶皂素EC50值体积比例为70∶30（质量比为1∶3.8）进行混配较为合理[12]。本试验可以为茶叶炭疽病和茶叶轮斑病绿色防治提供科学的参考。最近国内外报道了茶皂素作为一种非离子型表面活性剂，可进一步增强农药在生物体表面粘着力和剂在靶体表面的持留能力，从而提高农药对病害的田间防治效果[10]。但是关于博落回生物碱和茶皂素在茶园的田间协同防治效果还亟需进一步开展田间防效研究，还需结合对非靶标生物的安全性及其对茶园天敌昆虫等有益生物的影响，这将对茶园科学防控和绿色防控具有重要的指导意义。