廖小花，冯国丹，钟细妹，谢家滨

广东省深圳市宝安区松岗人民医院妇产科，广东深圳 518000

子宫内膜异位症是指内膜细胞在子宫腔内膜以外异位生长，是女性常见的一种疾病，虽然现如今还没有阐明发病机制，有研究显示炎症因子与血管内皮生长因子对子宫内膜异位有重要影响[1-3]。茯苓提取物主要成分包含脂肪酸、多糖和酶等，茯苓提取物具有抗肿瘤、免疫、抗炎剂、抗醛固酮等功效，药理活性较为良好，茯苓有悠久历史，具有健脾宁心、利水渗湿等作用，能够与多种药物共同使用，其中有代表性的为桂枝茯苓汤。相关资料显示，采用和茯苓提取物能够对子宫内膜异位机体进行治疗，具有良好成效[4-6]，所以本研究选择2020年1月—2021年1月广东省医学实验动物中心饲养的100只雌性大鼠为研究对象，分为5组，分析茯苓提取物对子宫内膜异位症大鼠治疗作用及机制的研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择100只雌性成熟SD大鼠为研究对象，体质量均在205~220 g。饲养温度为22 ℃左右，做实验大鼠自由饮食和饮水，观察动物体重和进食情况，大鼠属于SPF级大鼠。

1.2 方法

1.2.1 构建大鼠模型 在建模前24 h内，给予每只大鼠0.2 mg戊酸雌二醇（国药准字J20171038∶规格：1 mg），在造模阶段，采用浓度为2%的戊巴比妥钠（国药准字H31020240），按照40 mg/kg进行麻醉[7-9]。进行无菌处理，选择尿道口上端大约1 cm位置，做为切入点，沿着大鼠腹中线切开2 cm的纵形切口，将结扎右侧子宫分离，选择中间段位置1.5 cm处，将大鼠宫腔剪开，子宫组织选取5 mm×5 mm大小，应用生理盐水冲洗，在冲洗后将子宫组织以内膜面贴向左侧腹膜血管丰富位置，使用非吸收性缝合子宫组织四角，关闭大鼠腹部，手术之后3 d，为大鼠注射青霉素钠（国药准字H45021515；规格：40万单位），手术第10天开始，给予大鼠0.02 mg戊酸雌二醇，连续灌胃5 d。建模1个月之后，选择动情大鼠，进行剖腹检查，观察大鼠移植的子宫内膜体积增大，呈现透明形状，内部积聚液体，有血管形成，说明建模成功[10-12]。

1.2.2 分组处理 选取100只雌性大鼠，将大鼠分为5组，分为模型组，茯苓提取物低剂量组（0.5 g/kg）、中剂量组（1 g/kg）、高剂量组（1.5 g/kg）、生理盐水组，每组大鼠20只，所有大鼠均在建模后给药。治疗后处死大鼠，在大鼠腹部主动脉取血，同时需要留取腹腔积液，维持3 min离心，2 000 r/min，在-80 ℃环境下冷冻代用。使用浓度为10%的甲醛溶液（国药准字H43020198），进行固定，固定时间为2 h，通过梯度脱水等处理，然后染色，在光学显微镜下观测。每7 天为1个疗程，治疗时间为1个月。

1.2.3 ELISA检测肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF-α），前列腺素（prostaglandin E2, PGE2），环氧化酶（cyclooxygenase 2, COX-2） 根据标准在各组中加入血清，显色孵育之后，在450 nm处检测各孔吸光值。对比实验大鼠TNF-α、PGE2、COX-2。

1.2.4 TUNEL法检测细胞凋亡 移植病灶石蜡切片脱蜡至水，根据Tunnel试剂盒进行检测，采用CMIAS软件进行分析。

1.2.5 免疫组化检测血管内皮生长因子 （vascular en⁃dothelial growth factor, VEGF），基质金属蛋白质（matrix-metal proteins, MMP-9），平滑肌肌动蛋白（smooth muscle actin, SMA-α），增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA），雌激素受体（estrogen receptor, ER）和孕激素（progesterone,PR）。

移植病灶采用常规石蜡制片，采用光镜观察，对比实验大鼠 VEGF、MMP-9、SMA-α、PCNA、ER、PR。

1.3 统计方法

采用SPSS 26.0统计学软件对数据进行分析，计量资料经检验符合正态分布，以（±s）表示，组间差异比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验大鼠TNF-α，PGE2，COX-2对比

实验大鼠TNF-α，PGE2，COX-2，模型组与生理盐水组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。模型组与低剂量组、中剂量组、高剂量组分别进行比较,差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 实验大鼠中TNF-α，PGE2，COX-2值对比[(±s)，μg/L]

表1 实验大鼠中TNF-α，PGE2，COX-2值对比[(±s)，μg/L]

组别模型组生理盐水组P值/t值模型组：生理盐水组低剂量组P值/t值模型组：低剂量组中剂量组P值/t值模型组：中剂量组高剂量组P值/t值模型组：高剂量组例数20 20 20 20 20 TNF-α 19.49±2.20 19.53±2.19 0.954/0.058 14.49±2.02<0.001/7.487 13.49±1.67<0.001/9.715 12.49±1.70<0.001/11.260 PGE2 223.49±13.28 222.98±12.67 0.902/0.124 168.49±13.28<0.001/13.097 143.49±14.28<0.001/18.347 128.49±15.30<0.001/20.971 COX-2 57.49±9.28 57.98±9.67 0.871/0.164 33.49±8.28<0.001/8.630 31.49±8.28<0.001/9.349 29.49±9.28<0.001/9.541

2.2 实验大鼠 VEGF,MMP-9,SMA-α，PCNA，ER和PR对比

实验大鼠VEGF,MMP-9,SMA-α，PCNA，ER和PR，模型组与生理盐水组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；模型组与低剂量组、中剂量组、高剂量组分别进行比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 实验大鼠VEGF，MMP-9，SMA-α，PCNA，ER和PR对比(±s)

表2 实验大鼠VEGF，MMP-9，SMA-α，PCNA，ER和PR对比(±s)

组别模型组生理盐水组P值/t值模型组：生理盐水组低剂量组P值/t值模型组：低剂量组中剂量组P值/t值模型组：中剂量组高剂量组P值/t值模型组：高剂量组例数20 20 20 20 20 VEGF（ng/L）1.35±0.19 1.30±0.20 0.423/0.811 1.20±0.12 0.005/2.985 0.21±0.02<0.001/26.685 0.20±0.02<0.001/26.919 MMP-9（kD）43.60±1.59 43.64±3.60 0.964/0.045 25.80±2.42<0.001/27.491 28.70±3.19<0.001/18.695 24.70±4.20<0.001/18.821 SMA-α（kDa）43.60±1.59 43.64±3.60 0.964/0.045 31.80±2.42<0.001/18.225 29.70±2.20<0.001/22.901 28.60±2.59<0.001/22.073 PCNA（kD）13.20±1.42 13.10±2.20 0.865/0.171 31.20±2.42<0.001/28.689 29.10±2.20<0.001/27.156 27.10±2.20<0.001/23.740 ER（kD）0.60±0.01 0.60±0.02 1.000/0.000 0.32±0.01<0.001/88.544 0.33±0.01<0.001/85.381 0.37±0.03<0.001/32.527 PR（kD）0.26±0.03 0.25±0.02 0.222/1.240 0.21±0.01<0.001/7.071 0.19±0.02<0.001/8.682 0.20±0.01<0.001/8.485

3 讨论

茯苓性甘味淡，既可以健脾，同时对胃部有益，又能够扶助正气，治疗血液运行不畅等疾病。子宫内膜异位在中医角度上分析，属于痛经范畴，因此需要活血化瘀药物治疗。茯苓主要药理主要取决于三萜类化合物和多糖成分。三萜类化合物结构与醛固酮的化学结构相似，主要作用于肾远曲小管和肾皮质集合管，增加对Na+的重吸收和促进K+的排泄，也作用于髓质集合管，促进H+的排泄，酸化尿液，茯苓提取物可能通过拮抗醛固酮而发挥利尿作用，同时三萜类化合物对吞噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞以及细胞因子等进行免疫调节作用，且对特异性细胞免疫具有增强作用，对非特异性免疫也具有调节作用，或许可能用于治疗EMs，但目前并未研究茯苓提取物治疗EMs作用[13-16]。在本研究中，高剂量组TNF-α低于其他4组，说明采用高剂量茯苓提取物，可以抑制TNF-a的表达，因此具有采用此药物可以作为治疗，患者子宫内膜异位症状可以得到缓解。血管形成最关键的因子是血管内皮生长因子，腹腔内出现异位病灶需要有新血管生成，因此VEGF与子宫内膜异位症相关，可以作为评价因子。在本研究中，高剂量组、中剂量组、低剂量组得到治疗后VEGF值分别为（0.20±0.02）ng/L、（0.21±0.02）、（1.20±0.12）、因此，采用此药物可以减少内皮生长因子形成，具有一定效果。

孕激素受体占主导的内膜组织随经血逆流进入腹腔后，容易形成病灶的定植、侵袭和生长。孕激素抵抗是EMs发病过程的重要特点之一[17-19]。其结果提示在异位病灶中雌激素主要调控雌激素受体，从而表现为促炎和抗炎双重作用。本次研究结果显示，对比实验大鼠TNF-α，PGE2，COX-2，模型组与生理盐水组比较，差异无统计学意义（P>0.05），与其他3组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。茯苓提取物治疗能够有效缓解子宫内膜异位症患者的各种临床症状。采用茯苓提取物治疗，能够使机体各项炎症因子和指标得到缓解，有利于调节雌激素和孕激素，具有促进抗炎的作用功效，所以能够在临床上得到应用[20]。对比实验大鼠MMP-9,SMA-α、PCNA、ER和PR，模型组与生理盐水组比较，差异无统计学意义（P>0.05），与其他3组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。姜悦航等[21]研究指出，采用茯苓多糖提取物调控小鼠炎症，为改善小鼠病情，结果显示茯苓多糖对TNF-α水平具有一定影响，茯苓多糖剂量的增加，小鼠TNF-α水平逐渐减少。本研究中TNF-α值为分别为模型组（19.49±2.20）μg/L、生理盐水组（19.53±2.19）μg/L、低剂量组（14.49±2.02）μg/L、中剂量组（13.49±1.67）μg/L、高剂量组（12.49±1.70）μg/L,由此可以了解逐瘀汤也可以缓解内膜异位症状，与本研究结果一致。

综上所述,茯苓提取物可以抑制炎症因子生成，使炎症因子表达维持正常，患者免疫耐受能力也会降低，避免病灶持续生长。采用茯苓提取物，可以调节MMP-9和VEGF的含量，使子宫内膜异位无法继续生长，对缓解患者病情有重要意义，可以得到广泛应用。