李曹杰 李嘉浚 陈荣新

（1复旦大学附属中山医院肝肿瘤内科 上海 200032； 2复旦大学肝癌研究所 上海 200032）

据全球癌症统计，肝细胞癌（以下简称：肝癌）是全球第六大最常见癌症和第四大癌症死亡原因［1］。肝癌的主要病因是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染、非酒精性脂肪性肝病、黄曲霉毒素暴露、饮酒、肥胖和某些遗传性疾病等［2］。肝癌发生发展与这些致病因素导致的肝脏慢性炎症、过度纤维化、肝硬化，肝脏微环境严重紊乱，特别是免疫微环境失调存在密切关系。与其他实体肿瘤不同，80%～90%的肝癌起源于肝炎、肝纤维化和肝硬化演进过程［3］。

微环境对于肿瘤发生发展的重要性已得到大家公认；其对肿瘤的影响包括维持增殖信号、逃避生长抑制因子、抵抗细胞死亡、使复制永生、诱导血管生成、激活侵袭转移、能量代谢重编程以及逃避免疫［4］。由于肝癌微环境复杂，Affo 等［5］提出将肝癌微环境分为癌前微环境和肿瘤微环境：先于肝癌发生，以肝细胞死亡、慢性炎症和纤维化为特征是癌前微环境；肝癌发生后，与肿瘤共同发展演进的微环境称为肿瘤微环境。微环境中间质细胞，包括髓系来源细胞、淋巴细胞、内皮细胞、成纤维细胞，通过细胞之间直接接触、可溶性因子旁分泌或者细胞外基质等相互作用，促进肝癌发生发展［6］。本文就肝纤维化因素如何影响免疫微环境，及其促进肝癌发生发展的途径和机制，作一综述。

肝纤维化因素肝脏微环境由多种间质细胞成分，包括肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）、巨噬细胞、内皮细胞、免疫细胞、炎症细胞，和非细胞成分（如生长因子、蛋白水解酶及其抑制剂）以及其他细胞外基质蛋白组成［7］。肝纤维化过程包括HSC 激活，以及细胞外基质沉积导致肝脏组织生理生化、物理结构和功能异常。肝损伤发生时，HSC从静止状态维生素A 储存细胞转分化为α-SMA 阳性、产生胶原的肌成纤维细胞［8］。研究表明［9］，活化的HSC 是肝纤维化的主要贡献者，而与具体致病因素无关。HSC 也是癌相关成纤维细胞（cancerassociated fibroblasts，CAF）的主要来源，在肝癌发生发展中发挥重要作用［5］。利用单细胞测序技术，发现Tcf21 特异性表达于HSC，Tcf21+ HSC 是肝纤维过程中肌成纤维细胞和肝癌CAF 主要细胞来源［10］。激活的HSC、肌成纤维细胞、CAF 通过多种途径及机制影响免疫微环境，使免疫细胞发生功能障碍，形成免疫抑制性微环境，促进肝癌发生发展［11］。文献提示HSC 可能在抗原呈递和T 淋巴细胞启动中起直接作用，但这仍需要深入研究［12-13］。

除了HSC 异常激活以外，肝纤维化主要表现形式为细胞外基质蛋白大量沉积、排列、交联，产生生物化学和物理改变。细胞外基质糖胺聚糖、蛋白聚糖构成复杂的支持网架结构，结合很多生长因子、细胞因子、趋化因子、透明质酸等具有调节组织和细胞的功能。除了这些生化因素，基质蛋白沉积、交联产生的基质硬度/弹性，这一生物物理因素也对肝癌发生发展起重要作用［14］。

肝纤维化对免疫微环境影响肿瘤发生发展与机体免疫系统存在密切关系。固有免疫细胞，如巨噬细胞、树突状细胞（dendritic cell，DC）和自然杀伤（natural killer，NK）细胞，是机体的第一道防线。先天免疫细胞、适应性免疫T 细胞和B 细胞一起构成免疫监视，会限制肿瘤发生发展。研究发现，CD8+细胞毒性T 淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）、CD4+T 细胞（Th1）、NK 细胞和DC 等功能障碍，参与了免疫抑制微环境形成［15］。固有免疫和适应性免疫共同构成免疫监视，肝癌发生发展与免疫细胞的肿瘤监视功能失败有关［6］。

固有免疫

骨髓源性抑制细胞根据表型、形态学特征将骨髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC）分为两个主要亚群：多形核细胞（polymorphonuclear，PMN）和单核细胞（monocytic，M）的MDSC，即PMN-MDSC 和M-MDSC，分别与中性粒细胞和单核细胞具有相同的表型和形态特征［16］。MDSC 是从肥胖到癌症各种病理状况下产生的异质性细胞群，其显著特征是具有抑制T 细胞的功能［17］。某些情况下，M-MDSC 有比PMNMDSC 更高的免疫抑制活性［18］。值得注意的是，肝纤维化微环境中HSC 在单核细胞分化为MDSC 中起作用。在一种原位肝癌小鼠模型的研究中发现中，HSC 增加了肝癌中MDSC 数量［19］。将外周血单核细胞与活化HSC 共培养研究，结果出现了与MDSC 具有相似表型和功能特征的CD14+HLADR-/low细胞，表明活化的HSC 可以将成熟的外周血单核细胞转化为MDSC，而且这个过程可被CD44抗体阻断［20］。另有研究报道［21］，HSC 通过过氧化氢酶介导的过氧化氢耗竭，诱导了CD14+HLA-DRlow/-抑制性细胞产生。此外，活化的HSC 通过COX2-PGE2-EP4 信号途径诱导MDSC 聚集，促进肝癌生长［22］。通过肝纤维化动物模型和临床标本验证，纤维化肝脏中M-MDSC 积聚与肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）减少、肝癌发生显著相关；机制上，HSC 通过p38 MAPK 介导的增强子重编程诱导M-MDSC 聚集和免疫抑制［23］。肝癌中MDSC 不仅通过抑制NK 细胞抑制固有免疫应答［24］，而且可以抑制适应性免疫应答，能够诱导CD4+CD25+Foxp3+调节性T 细胞（Treg）［25］，抑制CD8+T 细胞免疫效应［26］，发挥免疫抑制作用。深入研究发现，肝细胞或肝癌细胞通过CCRK 激活EZH2/NF-κB/IL-6 信号级联反应，导致PMNMDSC 在肝癌中异常集聚，从而抑制INF-γ+TNFα+CD8+T 细胞免疫浸润，促进肿瘤发生［27］。去除内源性免疫抑制细胞如MDSC、Treg 和PD-1（+） T 细胞，能够恢复晚期肝癌患者CD8+T 细胞功能［28］。以上这些研究提示肝纤维化微环境有利于MDSC产生，MDSC 免疫抑制功能促进肝癌发生发展。

肿瘤相关巨噬细胞肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM）起源于外周血循环单核细胞前体，通过肿瘤来源信号，如MCP-1 和M-CSF 募集到肿瘤微环境中［29-30］。一般来说，单核/巨噬细胞可以极化为M1 或M2 型巨噬细胞。TAM 被认为更类似于M2 极化的巨噬细胞。微环境中，TAM 通过前列腺素E2（PGE2）、白介素-10（IL-10）和吲哚胺2，3-双加氧酶（IDO）诱导Treg 产生，通过CCL17、CCL18 和CCL22 趋化因子招募Treg；Treg 产生的IL-10 可以诱导单核细胞表达PD-L1，以上途径均导致肿瘤微环境中T 细胞受到抑制［31］。临床研究和小鼠实验模型显示，TAM 具有免疫抑制作用，促进肿瘤发生发展，也是潜在治疗的靶标［32-33］。TAM 在促进肝纤维化方面发挥重要作用［34-37］。HSC 对于TAM 也有影响，当单核细胞与HSC 共同培养时，细胞表面CD14、CCR2 和CD15 表达增加，CD86 表达下调，将细胞因子表达从促炎信号转变为免疫抑制信号，即上调免疫抑制细胞因子和下调炎症性细胞因子［38］。肝癌细胞与TAM 存在互动，肝癌细胞分泌Wnt 配体通过Wnt/β-catenin 信号通路促进TAM 向M2 型极化，从而促进肝癌增殖、侵袭转移和免疫抑制［39］。CCL2/CCR2 信号轴介导了巨噬细胞在肝癌中浸润。CCR2 拮抗剂阻断肝癌浸润巨噬细胞介导的免疫抑制效应，增加CD8+T 细胞数量，抑制肝癌生长［40］。这些研究提示，肝纤维化微环境中HSC 促进TAM形成，TAM 通过抑制免疫促进肝癌发生发展。

NK 细胞NK 细胞是第一个天然淋巴样细胞家族的成员，具有特殊细胞溶解功能的主要群体细胞［41］。Li 等［42］发现肝癌来源的CAF 诱导NK 细胞功能障碍，使其低表达细胞毒分子，减少细胞因子产生，体外对K562 靶细胞杀伤活性下降。活化成纤维细胞通过PGE2 和IDO 抑制NK 细胞激活，促进肝癌进展。Tan 等［43］发现磷酸化Tim-3 通过干扰PI3K/mTORC1 信号通路激活，抑制NK 细胞功能并抑制其细胞因子分泌，从而促进肝癌生长。另一方面，NK 细胞与肝纤维化存在关系。小鼠模型中，NK 细胞可以通过杀伤HSCs 和产生IFN-γ 缓解肝纤维化。Shi 等［44］发现在肝硬化情况下，激活的HSC 通过TGF-β 依赖性方式损害NK 细胞的抗纤维化能力。

DC 细胞DC 细胞是专职的抗原呈递细胞，在激活幼稚T 细胞和启动适应性免疫应答中具有重要作用。在大多数肿瘤中存在一部分调节性DC，诱导Treg 分化，具有较低的促进T 细胞增殖能力和较高促进免疫耐受的能力，帮助肿瘤细胞逃避免疫防御［45］。研究表明，微环境对于DC 功能有重要影响，Cheng 等［46］报道了肝癌来源的CAF 通过IL-6 介导STAT3 激活，招募DC 并且促使其转化为产生IDO 调节性DC，表现出免疫耐受性表型，具有显著抑制T 细胞增殖和上调Treg 产生的能力。另一方面，肝纤维化小鼠模型中，DC 通过产生基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9），促进肝纤维化消退［47］。

中性粒细胞中性粒细胞是肿瘤内浸润最多的免疫细胞之一，对于肿瘤发生发展具有重要作用［48］。中性粒细胞可以通过抑制抗肿瘤免疫，促进肿瘤免疫逃逸。Cheng 等［49］发现肝癌来源的CAF通过IL6-STAT3-PD-L1 信号调控肝癌相关的中性粒细胞的存活、激活及抑制免疫的功能。有趣的是，Harty 等［50］和Saijou 等［51］报道肝纤维化小鼠动物模型中，中性粒细胞通过MMP 减轻肝纤维化，促进肝脏修复。

适应性免疫

T 细胞T 细胞主要在胸腺发育，产生CD4+或CD8+单阳性胸腺细胞，最终以CD45RA+CCR7+表型的幼稚T 细胞形式出现在外周。CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞，占CD4+单阳性胸腺细胞的9%～10%［52］。肿瘤微环境中，识别出导致T 细胞功能障碍的潜在驱动分子，对于肿瘤免疫治疗具有重要意义［53］。炎症相关肝癌小鼠模型中，CD8+T 细胞和淋巴毒素-β 有促瘤功能［54］。纤维化微环境中，HSC 通过多种途径和机制影响T 细胞功能。Yu 等［55］发现HSC 诱导的T 细胞低反应性与B7-H1/PD-1 介导T细胞凋亡有关。随后一系列研究表明，活化的HSC通过诱导T 细胞低反应性，并加速激活效应T 细胞凋亡，增加Treg 细胞数量，抑制T 细胞介导细胞毒作用，发挥其免疫抑制作用［56-61］。

B 细胞B 细胞是机体体液免疫的主要细胞。目前，B 细胞在肝癌发展中的作用尚存争议。B 细胞与局部免疫激活及肝癌患者的预后有关；肝癌小鼠模型中，通过抗CD20 抗体去除B 细胞，降低局部T 细胞激活，促进肝癌生长［62］。另一项Mdr2-/-炎症相关肝癌小鼠模型的研究发现，抗CD20 抗体去除B 细胞，促进HSC 细胞衰老介导的肝纤维化消退，抑制TNF-α/NF-κB 促癌通路，减少肝癌发生；人肝癌标本中，B 细胞浸润与肝癌侵袭性增加、无瘤生存率降低相关［63］。

肿瘤微环境的其他因素

转化生长因子转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）由微环境中多种细胞产生，例如肌成纤维细胞、T 细胞、巨噬细胞和内皮细胞，并储存在细胞外基质中［64-65］。肝癌发生发展中TGF-β 起着双重作用。早期肝癌发生过程中，TGF-β 发挥抑制肿瘤作用；一旦细胞对其抑制作用产生抵抗后，TGF-β 作用就转为促癌作用，促进细胞存活，诱导细胞迁移和侵袭［65］。肝纤维化微环境中HSC 或CAF 可通过产生TGF-β，促进免疫抑制性微环境形成。TGF-β 通过调节各种免疫细胞，涉及NK 细胞、DC 细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、CD8+、CD4+T 细胞以及Treg 细胞，促进肿瘤发生发展［66-67］。在TGF-β 水平较高的情况下，TAM 主要极化为M2 表型［68］；CAF 以TGF-β 依赖方式上调Treg产生［69］；TGF-β 诱导转录因子Foxp3 表达，该转录因子参与了幼稚T 细胞向具有强大免疫抑制功能的CD4+CD25+Treg 细胞转变［70］。抑制TGF-β 可显著增强肿瘤对PD-1/PD-L1 检查点抑制剂治疗敏感性，增强抗肿瘤疗效［71-72］。

肝纤维化微环境中细胞外基质细胞外基质（extracellular matrix，ECM）主要由激活的HSC 产生［8］。肝癌微环境中，肿瘤细胞释放TGF-β1 诱导HSC 产生大量细胞外基质成分，如纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原等。异常ECM 提供了一个物理屏障，阻止免疫细胞浸润［73］。细胞培养实验表明［74］，在玻璃上培养的单核细胞分化为类似于活化巨噬细胞，对肿瘤细胞具有细胞毒性。纤维化环境下，ECM 蛋白成分和含量明显改变，通过细胞表面受体（包括整联蛋白、CD44、RHAMM、GPVI、LAIR-1［75］、OSCAR 或GPR56）直接或间接影响浸润的免疫细胞功能，从而改变免疫反应［76］。

代谢酶必需营养素的耗尽以及免疫抑制代谢物积累会产生适合肿瘤发展的微环境［77］。微环境中免疫抑制代谢物主要是经IDO 和色氨酸2，3-双加氧酶（TDO）、精氨酸酶降解色氨酸、精氨酸而产生，能抑制多种免疫细胞活性，包括：CTL、Th1细胞、Treg 细胞、MDSC 等［78］。IDO 活性升高，促进机体对肿瘤相关抗原的病理性免疫耐受，是肿瘤细胞逃避免疫系统防御的一种机制［79］。研究表明，IDO 与PGE2 共同介导了肝癌来源CAF 对 NK 细胞活性的抑制作用［42］。

基质硬度基质硬度促进肝癌发生发展，但是否通过调控免疫微环境促进肝癌进展并不清楚。基质硬度还促进HSC 激活、巨噬细胞M2 极化、T细胞增殖、迁移、DC 细胞表型调控［80-83］及肺癌细胞PD-L1 表达［84］。基质硬度促进CAF 形成和激活，胰腺癌中CAF 分泌βig-h3 调控免疫微环境，促进胰腺癌进展［85］。

结语目前，肝癌靶向治疗药物（如sorafenib、regorafenib、lenvatinib、cabozantinib［86-89］）对患者生存率的改善有限，免疫治疗出现为肝癌治疗提供了全新的局面［90］。肝纤维化与免疫细胞存在密切互动关系，肝纤维化促进免疫抑制微环境形成，促进肝癌发生发展。从中寻找新的免疫治疗靶点与途径，对进一步提高免疫治疗效果具有重要意义。

作者贡献声明李曹杰 论文构思、撰写和修订，文献检索。李嘉浚 论文整理、撰写和修订，文献检索。陈荣新 论文构思和修订。

利益冲突声明所有作者均声明不存在利益冲突。