李春艳，刘芳婷，张王斌

(塔里木大学/南疆农业有害生物综合治理兵团重点实验室/农业农村部阿拉尔作物有害生物科学观测实验站，新疆阿拉尔 843300)

0 引 言

【研究意义】苹果(Maluspumila)蔷薇科苹果亚科苹果属植物[1]。2019年新疆苹果种植面积2.3×104余hm2[2]由病毒和类病毒引起的苹果外观异常，导致苹果品质变劣，产量下降[3-4]。【前人研究进展】类病毒是迄今为止发现的最小病原物，是一类单链共价闭合环状的裸露RNA分子,通常含330个左右核苷酸[5-7]。类病毒病害在我国苹果上发生的主要有三个：苹果锈果类病毒 (Apple scar skin viroid，ASSVd)、苹果皱果类病毒 (Apple fruirt crinkle viroid，AFVCd)、苹果凹果类病毒 (Apple scar skid viroid，ADFVd)[8]。病毒病病害在我国苹果上发生的主要有6种[9-10]：苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus，ASGV)、苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus，ASPV) 如苹果绿皱果病毒(Apple green crinkle virus，AgrCV)、苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid，ASSVd)和苹果花叶病毒(Apple mosaic virus ,ApMV)。苹果外观异常与苹果锈果类病毒病病状相似，侵染后通常表现为锈果型、花脸型、锈果-花脸混合型、环斑型和绿点型等症状[11-12]。已有在新疆苹果树、梨树、杏树、桃树上苹果锈果类病毒的报道[13-15]。【本研究切入点】有关基于高通量测序对引起新疆阿拉尔苹果外观异常病原的鉴定文献较少，以高通量基因测序技术[16]为研究手段，需对引起阿拉尔苹果外观不同情况异常病原进行鉴定分析。【拟解决的关键问题】采用田间调查和高通量基因测序技术，调查与分析引起阿拉尔苹果外观异常的病原种类、症状、发生情况，确定引起阿拉尔苹果外观异常的病毒种类，为防治该病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

于2019年10月新疆阿拉尔六团一连(N40°57′42″，E80°28′49″，海拔1 070 m)不同苹果园随机采集6份有显著症状的苹果果实样品和无明显症状的枝条样品。表1

表1 样品基本信息Table 1 Basic sample information

1.2 方 法

1.2.1 发病率调查

选取新疆阿拉尔六团一连西一垄、西二垄、西三垄、西四垄地块为调查地，在每垄各个果园中用五点取样法分别选取40株果树，记录栽植信息，描述症状并统计发病率。表2

表2 调查地基本信息Table 2 Basic information of the survey site

1.2.2 苹果病毒分子检测宏转录组法

1.2.2.1 RNA提取

组织样品RNA提取采用 TRizol 试剂(天根生化科技(北京)有限公司)进行提取。

1.2.2.2 建库测序

利用带有Oligo(dt)的磁珠对含有ploy(A)尾的mRNA富集，将mRNA打断成短片段合成cDNA，纯化后末端修复、加A尾并连接测序接头，最后进行PCR扩增。

1.3 数据处理

使用DPS7.55软件进行差异显著性分析(α= 0.05)。

对原始下机数据(Raw Data)进行预处理，得到有效数据(Clean Data)。数据使用Trimmomatic软件进行质控，质控后将得到高质量序列clean reads，然后基于有效数据进行宿主数据去除，分析病毒物种分类分析和复杂度，拼接与组装等。

将测序得到的各病毒基因序列通过MEGA7.0构建系统发育进化树，采用 Clustal W算法对序列进行比对，采用邻接法(Neighbor-joining，NJ)构建系统发育树，自展校正值设为1000，其余使用软件默认设置。构建进化树的序列来自于 NCBI。表3

表3 GenBank 已登录苹果全长基因组的分离株Table 3 GenBank has logged into the isolates of the full length apple genome

2 结果与分析

2.1 苹果外观异常分类描述

研究表明，田间苹果外观异常表现为果实畸形型、裂果型、和着色异常型3种类型。果实畸形型：果实表面不平滑，呈纵向凹陷状，色泽分布不均匀；裂果型：果面或果顶部出现锈斑，不规则的锈斑从苹果顶部向四周蔓延，严重时果实锈斑处开裂；着色异常型:果实从着色时开始表现症状，在果面出现近圆形黄绿色斑块，表现出红黄相间的“花脸状”，着色部分隆起，用手摸起来凹凸不平。其中黄绿色病斑面积与果实的表面积之比依次递增。图1～3

注:A:底部俯视图 B:正面俯视图 C：背面俯视图

注:A: 黄元帅田间表现；B：新世纪正面俯视图；C:新世纪底部俯视图

注:A-D：短枝富士田间症状观察结果

2.2 不同品种间苹果外观异常症状及发病情况

研究表明，不同品种间发病率与症状表现有所差异，王林的发病率最高为74.50%，与新世纪的发病率存在显著差异，表现为畸形症状；其次是短枝富士，发病率为70.50%，与王林、新世纪间的发病率差异不显著，表现为着色异常、裂果症状；发病率最低的为新世纪，达到了63.50%，表现为着裂果症状。3个品种间发病率虽有差异，但不显著。表4

表4 不同品种间苹果外观异常发病率比较Table 4 Comparison of the incidence of apple appearance abnormality among different varieties

2.3 不同地块间苹果外观异常发病比较

研究表明，对不同地块间苹果外观异常发病率调查结果进行分析，西一垄的发病率最高为83.20%，分别与西三垄、西四垄间发病率存在显著差异；其次是西二垄发病率78.20%，与西四垄间发病率存在显著差异；西三龙发病率为73.20%，分别与西一垄、西四垄间发病率存在显著差异；西四垄的发病率最低为47.20%，与其他3垄的发病率存在显著差异。表5

表5 不同果园苹果外观异常发病率比较Table 5 Comparison of the incidence of abnormal apple appearance in different orchards

2.4 苹果外观异常病原系统进化

研究表明，在王林上检测到5种病毒，分别为ASGV、ACLSV、ASPV、AgrCV、ApMV；在短枝富士上检测到3种病毒，分别为AgrCV、ASPV、ASGV；在新世纪上检测到4种病毒，分别为ASGV、ACLSV、ASPV、AgrCV。王林、短枝富士、新世纪都检测到了苹果茎沟病毒，DZFS-ASGV和WL-ASGV亲缘关系最近共同聚在一个分支上，但XSJ-ASGV与相似性为63%的印度苹果分离株(LT160740)亲缘关系最近聚在另一个分支上。王林、新世纪上也检测到了苹果褪绿叶斑病毒，WL-ACLSV和XSJ- ACLSV与相似性为100%的分离株(M58152)亲缘关系最近共同聚在一个分支上。王林、短枝富士、新世纪也检测到了苹果绿皱果病毒，XSJ-AgrCV和WL-AgrCV亲缘关系最近共同聚在一个分支上，但DZFS-AgrCV与相似性为96%的加拿大苹果分离株(HE963831)亲缘关系最近聚在另一个分支上。王林、短枝富士、新世纪也都检测到了苹果茎痘病毒，但都分别聚在不同的分支上WL- ASPV与相似性为100%的日本分离株(AB045371)亲缘关系最近聚在一个分支上，DZFS-ASPV与相似性为99%的印度分离株(FR694186)亲缘关系最近聚在另一个分支上，XSJ-ASPV单独为一个分支。表6，图4

表6 苹果外观异常携带病毒种类Table 6 The apple appears to carry an abnormal virus type

图4 苹果分离物核苷酸序列的系统发育Fig.4 Phylogenetic analysis of nucleotide sequences from apple isolates

3 讨 论

苹果果实外观异常原因较为复杂，已经报道的主要是苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid，ASSVd)引起的。不同品种苹果外观异常田间表现症状不同与时丕坤[17]观察结果一致。高通量测序技术检测出在3种不同品种、不同表现症状的苹果中均携带苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果茎痘病毒(ASPV)、苹果绿皱果病毒(AgrCV)，李鹏举等[18]在黑龙江省不同苹果产区的不同品种的苹果上也均检测到了苹果茎沟病毒(ASGV)。研究表明ASGV、ASPV、ACLSV在苹果树中呈混合侵染与杨洁萍等[19]结果一致。根据高通量测序结果显示，检测到的病毒有苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus，ASPV)、苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus，ASGV)、苹果花叶病毒(Apple mosaic virus，ApMV)和苹果绿皱果病毒(Apple green crinkle virus，AgrCV)5种类型，并未检测到有苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid，ASSVd)，但多病毒病的混合发生也表现出了类似苹果锈果类病毒病的症状，有待深入研究。

苹果类病毒和病毒病害目前无有效防治手段，加强果园管理可缓解病害症状的表现[20]，使用套袋技术可以促进苹果果面着色、提高果实的贮藏性和果实的商品价值[21]，但无法彻底根除及解决风味变差的问题。发病率的差异可能与果园土肥水管理，土壤情况，营养不均衡，树体衰弱，病毒容易入侵，负载量大等有关[22]。可以通过肥水管理措施，增强树势，提高树体的免疫力。合理负载，平衡树势，减小留果密度，及时补充营养等措施减轻病害的发生[23-24]。苹果一旦感染上病毒，很难防治，目前苹果病毒病尚无有效的防治药剂，只能通过预防手段加以控制，发现病株，立即拔除。培育无病毒母本，栽培无病毒苗木，加强植物检疫是防治病毒病的有效方法[25]。

4 结 论

4.1苹果外观异常田间症状主要有果实畸形型、锈果型、着色异常型三种类型。不同品种间病害症状表现有所差异。短枝富士表现为着色异常、裂果症状，携带病毒为AgrCV、ASPV、ASGV。王林主要表现为畸形症状，携带病毒为ASGV、ACLSV、ASPV、AgrCV、ApMV。新世纪表现为裂果症状，携带病毒为ASGV、ACLSV、ASPV、AgrCV。

4.2新疆阿拉尔苹果外观异常在阿拉尔六团一连平均发病率为70.45%。对不同品种间发病率比较分析，王林的发病率为74.50%，短枝富士发病率为70.50%，新世纪的发病率为63.50%，同一地块不同品种间的发病率无规律性。西一垄的发病率为83.20%，西二垄的发病率为78.20%，西三垄的发病率为73.20%，西四垄的发病率为47.20%，苹果外观异常发病率与不同地块间无相关性。