刘子毓 杨光穗 奚良 谌振

（1. 海南大学园艺学院 海南海口 570208；2. 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业农村部华南作物基因资源与种质创制重点实验室 海南海口 571101；3. 海南省热带观赏植物种质创新利用工程技术研究中心 海南儋州 571737）

睡莲是研究被子植物起源与演化的重要物种[1]。20世纪以来，睡莲的组织培养、跨亚属育种及生理生化的研究加速，世界各国开始大量引种，并对其适应性、多样性进行评估调查，加强新品种引种、培育和推广，培育代表性睡莲品种。当前对睡莲调控分子机制的研究更加深入，随着睡莲全基因组的相继报道，有关学者深入挖掘睡莲调控因子，各类机制逐渐清晰。睡莲除自身的观赏价值以外，产物和环境保护功能日益受到重视，应用范围不断扩大[1-2]。

1 种质资源与多样性

1.1 睡莲的资源与分布

睡莲为睡莲科（Nymphaeaceae）睡莲属（Nymphaea）植物通称，全属植物有80余种（包含变种），睡莲广泛分布在除南极洲外的各个大陆[3]。澳洲亚属主要分布于澳洲东北部，花型较大；古热带亚属分布于南亚和东南亚及非洲；新热带亚属主要分布于中美洲；耐寒亚属广泛分布于各大洲温带，花型较小，香味较淡；广热带亚属广泛分布于各大洲，颜色类型众多，部分品种有独特的“胎生”繁殖方式。原生种有5种原产于我国，即白睡莲（N. albaL.）、雪白睡莲（N.candidaC. Presl）、睡莲（N. tetragonaL.Georgi）、柔毛齿叶睡莲（N. lotusL.var. pubescens）和延药睡莲(N. stellataL. Burmann)[4-6]。海南省地处热带，是重要的睡莲繁育种植基地[7-8]。

1.2 睡莲的分类研究

早期研究中的睡莲物种鉴定分类以形态特征为基础。当前睡莲属植物分类方法分为2类，一是根据种群地理演化推论，以地区生态型将睡莲属植物分为热带睡莲和耐寒睡莲两大类，5个亚属—广温带睡莲亚属、广热带睡莲亚属、古热带睡莲亚属、新热带睡莲亚属、澳大利亚睡莲亚属[9]；二是基于形态特征—心皮的离生或聚合[10]。可根据心皮排列方式将睡莲属植物分为：离生心皮组和合生心皮组[11-12]。基于形态特征的离生合生心皮分类方法，一级分类标准是心皮的离生或聚合，但睡莲属植物的雌蕊都是聚合心皮，实际上心皮的离生或聚合是指心皮侧壁是否彼此分离；此标准中花柱为心皮背缝线和腹缝线末端延伸长出的附属物，并不具备传粉受精后运输受精卵的功能，并不能称之为花柱。

现在研究人员更倾向于用分子手段得到更精确的分子证据来研究睡莲的系统发育。刘艳玲等[13]进行ITS序列分析建树，张海平[14]基于形态学分类，皆将睡莲属分成4支；热带睡莲单独构成1支，其内部仍可分为2支，1支是以广热带睡莲为代表的广热带昼开夜闭型睡莲，另一支为以古热带睡莲为代表的夜开昼闭型睡莲，这与基于形态特征对睡莲属植物进行的分类结果一致。同时ITS区的分析结果也与二者的地理分布格局较为一致。耐寒睡莲植物以100%的支持率聚在一起构成单系类群。黄祥等[15]基于叶绿体密码子RSCU构树将20种睡莲分为3支[15]。Borsch等[16]对睡莲trnT-trnF的组合分析分为8个亚属。CORNELIA CORNELIA等[17]基于叶绿体系统发育将睡莲分为5个亚属。毛立彦等[18]对睡莲叶绿体基因组密码子构建系统进化树，支持2支论的观点。杨亚涵[19]对睡莲种质资源进行ISSR-PCR扩增，证明睡莲种质资源有着广泛且多样的演化路径和遗传多样性。

2 睡莲的无性繁殖

睡莲属植物的开花习性为雌蕊先熟，自然隔离使本属植物多为异花授粉。睡莲属植物无性繁殖能力强，睡莲块茎进行繁殖形成无性系，极少部分热带睡莲还能通过花胎生、叶胎生、走茎繁殖形成自己的无性系植株[20]。胎生可使其种群在较短时间内快速传播和扩散，适应多变的自然环境[21]。

目前生产实践中最普遍使用的是块茎繁殖。块茎繁殖，主要是耐寒睡莲，有Marliac型、Odorata型及Tuherosa型，在生长季进行分株繁殖，大部分品种繁殖系数高。球茎繁殖，主要是热带睡莲，越冬后春天在菠萝型球茎的顶端分生出许多小苗，待小苗生根后分株繁殖，有些种类在老球茎的基部生成许多小球茎，将球茎分开种植可形成新植株。走茎繁殖，是指部分夜间开花睡莲在生长旺季，老茎侧生出水平生长的新根状茎。这些分生出的小苗可以分离栽植[22]。睡莲分株通常于早春发芽前挑选有新芽的根茎，切成7~8 cm的小段，进行栽植。实际生产中将用于种植的睡莲种苗（球茎/块茎），种植前清理和清洗干净，剪除老根；采用0.1%的多菌灵浸泡消毒处理，使生长点与泥面持平，放入水田中，水深保持至生长点以上5~10 cm。

利用外植体进行组织培养可实现睡莲的快速高效繁殖，相比传统繁殖方法能更快更优地获得所需植株。外植体的接种是指把经过表面消毒处理的材料切割后转接到培养基上的过程。此过程在无菌条件下进行，主要包括修剪切割和接种2个过程。戚华沙等[23]以睡莲根茎、种子做外植体，成功率均达到75%以上。在此基础上，孙春青等[24]用幼胚做外植体，获得了最佳外源激素配比。此外，杨梦飞等[25]以不同试剂处理睡莲花粉，发现柱头液最适合花粉萌发，萌发率最高。黄秋伟等[26]发现，红色系Lotus亚属睡莲色素能够促进胎生睡莲芽点萌发，达到快速繁殖。

3 睡莲新品种育种

睡莲育种起源于19世纪，如Conard[27]培育百余种耐寒睡莲。20世纪以来，美国、泰国[28-29]也培育出众多新品种，如万维莎等，仍受到广大消费者的喜爱。睡莲育种以传统杂交育种为主，诱变、基因编辑技术等也逐渐得以应用。

3.1 杂交育种

近些年来我国育种家取得了许多成果，如吴倩等[30]人工杂交选育而成的新品种粉玛瑙，杨宽等[31]选育出新品种婚纱。我国青年育种家李子俊[32]培育出新品种金平糖、樱桃轰隆。

热带睡莲与耐寒睡莲染色体数目存在差异，跨亚属杂交难以成功。随着国内外育种人不断对跨亚属睡莲培育进行尝试，不同睡莲杂交亲和性也逐渐得到验证[33]。通过大规模杂交实验，将广热带睡莲同耐寒睡莲不断进行杂交授粉。我国青年育种家李子俊[32]培育出我国首个跨亚属品种侦探艾丽卡深受消费者喜爱。欧克芳等[34]培育出紫红色中大型跨亚属杂交睡莲紫妍，花型较大，显著区别于其他睡莲 。

3.2 诱变育种

除此之外，诱变育种成果显著，李淑娟等[35]用秋水仙素处理走茎，获得倍性变异植株。张启明等[36]通过辐照得到花量减少花色改变的变异新种；史明伟等[37]用60Co-γ辐照睡莲获得了变异植株。刘鹏等[38]以0.25%秋水仙素处理睡莲种子12 h，成功获得四倍体植株，诱导率最高为100%，成活率88%。近年来睡莲转基因育种也取得进展，Yu等[39]通过花粉管通道法构建了热带睡莲转基因体系，并通过将CodA基因转入热带睡莲株系，提高了睡莲的耐寒性，使睡莲地下茎获得低温抗性。

4 睡莲的分子研究

4.1 挥发物研究

花朵挥发物成分作为一类遗传性状，反映了物种的遗传规律。睡莲作为基部被子植物类群之一，对挥发物组成的研究，有助于明确被子植物虫媒特性演化过程。袁茹玉[40]对睡莲花的挥发性释放部位进行研究发现，挥发物释放量从多到少顺序依次为雄蕊、花瓣、雌蕊，雄蕊释放的挥发物最多，在热带睡莲中几乎可达到70%，在耐寒睡莲中可达到90%，明确了睡莲挥发物质的产生部位。Zhou等[41]将GC-MS结果同睡莲电镜结构进行比对发现，不同睡莲中花香物质挥发部位有所不同。通过镜下观察，推测花瓣中的渗透性基质颗粒与香气的形成有一定的关系，是香气释放的物质基础。

睡莲挥发物有别于其他常见芳香植物，含带有玫瑰和果香感的癸酸甲酯[42]。新热带亚属睡莲有特殊的辛香味挥发物，主成分是茴香醚[43]。黄秋伟等[44]对睡莲挥发油成分进行研究，确定主成分为十五或十七烷。石凝等[45]对睡莲鲜花精油的成分与含量进行了鉴定和分析，发现炔烃、烷烃、烯烃、醇和酮类化合物是主要成分，8-十六烯的相对含量最高。热带睡莲和耐寒睡莲花朵挥发物中的相对含量及挥发物种类均存在明显差异，2种生活型睡莲共有花香成分13种，其中烯烃类8种[46]。研究结果明确了睡莲挥发物结构功能的对应关系，为睡莲香气物质的开发利用提供了基础资料。

4.2 花色苷研究

近年花瓣花色素苷合成研究进展迅速。睡莲中花色素苷的合成途径较明确。在花色素组成、花色素生物合成途径等方面鉴定出花色素成分的化学结构，可明确花色形成过程与分子调控机制。朱满兰等[47]以耐寒睡莲不同花色的119个栽培品种为材料，利用高效液相色谱和液质联用技术测定了其花瓣中的花青素苷成分，发现8种独立于其他物种的花色苷，即Dp3Ga5acetyIGa)、Dp3Rh(1-2)Ga、Cy3Ga(1-2)Ga、Cy3acetylGa(1-2)Ga、Cy39alloylGa、Dp3acetylG、Dp3G和Cy3GaGaGa。田洁[48]也在睡莲泰国王花瓣中克隆到1个R2R3型MYB转录因子，并对其调控蓝色花形成的功能进行了初步验证。Wu等[49]使用高通量测序技术对蓝色热带睡莲品种“暹罗王”睡莲的2个不同着色阶段的花瓣进行Transcriptome分析，得出127个Unigene可被鉴定为其他物种颜色相关基因的推定同源物，其中包括28个上调的Unigene和5个下调的Unigene，确定了黄酮类化合物的组成和与蓝色形成相关的代谢途径，选择黄酮类化合物代谢途径的候选物，从而诱导花瓣的颜色形成，提供了关于睡莲花色形成过程的研究基础。目前可通过导入细胞色素基因，促进花色苷合成关键基因大量表达[50-51]，为分子层面调控花色，提供了理论可行性。

5 睡莲的基因研究

5.1 基因组研究

无油樟目（Amborellales）、木兰藤目（Austrobaileyales）以及睡莲目（Nymphaeales），三者被合称为被子植物早期分化类群。关于睡莲的具体演化定位，Zhang等[42,52]测定睡莲的全基因组，测得睡莲演化分支时间晚于无油樟，证实睡莲并非最早的被子植物分化类群，基因组共线性揭示了睡莲中全基因组重复（WGD）事件，通过睡莲同源基因对的Ks分布，确定睡莲目古多倍化的可能发生位置，复制事件发生在睡莲科与莼菜科分化之后。通过鉴定睡莲的MADS-box基因证实花器官发育ABCE模型并非严格对应，睡莲中AG基因具有2个拷贝AGa和AGb，分别在雄蕊和心皮中高表达，此外AGb同时还在花瓣和萼片中表达，说明睡莲中的2个AG基因发生了亚功能化以及新功能化。当下被子植物的严格ABCE模型是随着被子植物不断演化逐渐交叉形成的[53]。罗火林[54]发掘出睡莲花器官发育的AP2和AGL6基因，原应控制花萼与花瓣的基因也能影响雄蕊与心皮的形成，提出睡莲花器官发育的假定模型。确定ABC模型在被子植物起源的早期形成并发挥作用。以上研究证实了睡莲作为基部被子植物有着独特的演化类型和演化结果。

5.2 基因家族研究

在睡莲抗逆抗病机制研究上。叶方婷等[55]鉴定睡莲bZIP家族基因，发现其在茎、叶、花及雄蕊中具有表达特异性。茎叶中存在更多低温响应抗性元件，雄蕊和花瓣中存在更多应对生物胁迫和干旱的MeJA响应元件及ABA响应元件。对bZIP成员启动子的顺式调控元件进行分析发现，NcbZIP成员可能受到茉莉酸甲酯和ABA的调控。

潘鑫峰等[56]鉴定出69个NcWRKY转录因子，分为3个亚家族。WRKY成员上在14条染色体上均有分布，起到调控茉莉酸甲酯的功能。对基因家族成员在不同组织中的表达量分析，筛选出在成熟叶柄中高表达的NcWRKY04与NcWRKY18；在花瓣中高表达的NcWRKY05和在雄蕊中高表达的NcWRKY61。在WRKY转录因子如何在启动子层面调控植物的生长和发育过程，建立一个全面的WRKY信号和转录调控网络。

庄滢玉[57]发现，NBS-LRR基因家族虽然拥有较多的成员，但其表达量却普遍最低，推测该类基因需在外界刺激或者胁迫作用下才会表达。对上游序列进行了顺式作用元件预测，发现其存在着大量和生长素、赤霉素反应等相关的响应元件，暗示基因具有效应基因启动子，并能通过与转录因子结合，从而调控这些功能基因的起始转录和转录效率，引起一系列生理生化反应和响应基因的表达。

5.3 结构基因研究

除了对功能基因进行解析之外，也对结构基因展开研究。Chaipanya等[58]发掘出睡莲花瓣类黄酮合成途径中结构基因F3H，其在花瓣和雄蕊中大量表达，影响花朵的花青素积累。吴倩[59]在睡莲泰国王花瓣中克隆了类黄酮糖基转移酶基因（NnGT6），并对其功能进行了验证发现，该酶对花色素等均具有催化活性，促进蓝紫色花的形成。Zhang等[42]比较蓝色花和白花变种花瓣中存在差异的基因表达，推测花青素合酶基因（NC9G0274510）和类黄酮糖基转移酶基因（NC8G0218160）是其花色形成的关键结构基因。

陈凯利等[60]从睡莲叶片和花瓣中克隆了ANS（植物花青素合成酶）的基因序列、启动子和编码区序列，对该基因序列在睡莲不同花色发育时期的花瓣和不同组织部位表达进行分析，并针对启动子序列进行了顺式作用元件分析，预测上游调控因子，为深入研究该基因的功能和睡莲的花色形成分子调控机理奠定基础。苏群等[61]对叶胎生睡莲转录组进行研究，得到4个叶胎生发育转录因子，发掘出主要参与到植物激素信号转导、苯丙烷类生物合成、氨基酸类代谢的差异表达基因，诠释了叶胎生的发育机制。

6 展望

睡莲作为极具代表性的观赏型水生花卉，中国睡莲育种仅有20年的历史，在种质资源收集、育种优化、转基因和诱变育种方面取得了一定进展。利用外植体进行组织培养逐步实现睡莲的快速高效繁殖，逐步理清最佳激素配比，形成一套相对规范、可操作性强的栽培种植方法。除传统的杂交育种外，通过转基因和诱变剂获得多倍体新植株，相比传统繁殖方法能更快更优地获得所需植株，出现了更多丰富的品种可供研究。在关键性状上，分子研究明晰了睡莲花色素组成、花色素生物合成途径，明确花色形成过程与分子调控机制，导入色素基因，诱导花色形成。通过挥发物研究分析了睡莲香气的组成，明确了睡莲挥发物结构功能的对应关系，探明主要的香气载体。

睡莲基因组序列的破译为研究睡莲进化与功能基因组学分析提供了基础，证实了睡莲作为基部被子植物有着独特的演化类型和演化结果。在睡莲基因组中鉴定出不同基因家族成员，进一步分析其理化性质、系统进化关系、基因结构、染色体定位、基因复制事件等，在启动子层面调控植物。除了对功能基因进行解析之外，也对结构基因展开研究，已经发掘出睡莲花瓣类黄酮合成途径中结构基因及植物激素信号转导、苯丙烷类生物合成、氨基酸类代谢的差异表达基因。

睡莲大规模栽培经验少，在育苗选择、苗期管理、定植及日常管理方面缺乏清晰明确的操作规范。当前关于睡莲基因家族分析多聚焦于睡莲抗逆性机制，结构基因研究多集中在花色花香，对于病害机制缺乏深入研究。睡莲产物开发前景广阔，市场潜力巨大。但睡莲仍未纳入国家药食同源植物名单，制约着后期产品的开发与推广。对于睡莲的开发应落在产物的具体应用上，尽早投入社会，实现睡莲产业的全面发展。