刘佳悦，赵芳莹，张 琰，张 乐，苑金利，陈吉龙，刁洪秀

[1. 福建农林大学动物科学学院(蜂学学院) 福建省畜禽病原感染与免疫学重点实验室，福建 福州 350002 ；2.中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193]

生物体中的RNA种类繁多，功能复杂，按照是否编码蛋白质可将其分为编码RNA(Coding RNA)和非编码RNA(Non-coding RNA,ncRNA)两大类。随着转录组学的发展和数据的共享，ncRNA的功能研究进入了崭新的阶段，长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)在ncRNA 中占比最高，且功能最复杂，已成为国际生命科学领域的研究前沿。大量研究证实，lncRNA具有高度的组织特异性，在表观遗传、转录以及转录后等多重水平上对细胞网络进行调控，不仅参与机体的生长发育和生理过程，在多种疾病的发生发展过程中也扮演着重要角色，有望成为疾病治疗的靶点[1-3]。

我国一直是乳制品需求大国。根据中国海关数据，2021年中国乳制品净进口385.2万吨，同比增加18.1%，增速是2020年的2倍[4]，乳制品总需求快速增长。此外，中国乳制品消费水平位于全球前三，奶牛养殖业在国内具有很大的发展潜力，然而奶牛相关疾病的致病机理尚不明确，对于相关疾病的诊断主要依赖于发病后各项生理指标的检测，此时往往已经造成了不可挽回的损失。因此，从基因水平上了解疾病的致病机理对于奶牛临床疾病的防治至关重要。本文围绕近年来lncRNA在奶牛临床常见疾病领域的新进展及研究策略进行综述，并展望了lncRNA在奶牛临床常见疾病中的研究方向，以期为奶牛相关疾病的防治提供新思路。

1 lncRNA概述

哺乳动物基因组中很大一部分都被转录成mRNA，然而只有约1.5%的转录本编码蛋白，其余转录本均为ncRNA[5]。lncRNA曾经被认为是DNA转录异常产生的“垃圾RNA”，尽管缺乏编码能力，但lncRNA与mRNA仍有许多共同的特征，包括：(1)具有组蛋白标记的活性启动子；(2)有5′-帽子和Poly-A尾巴；(3)多外显子转录本的剪接[6]。与mRNA相比，许多lncRNA的表达相对较低，进化上的保守性较差，并且具有高度的细胞类型或组织特异性[7]。近年来，随着新一代测序技术和生物信息学技术的进步，大量研究表明,lncRNA可通过不同机制调节先天免疫反应、免疫细胞的分化和发育、炎症性疾病和自身免疫性疾病等许多免疫过程[8]。lnc641可通过抑制JAK-STAT1途径来促进伪狂犬病毒的复制[9]。linc-satb1可通过上调免疫应答基因和细胞免疫来破坏马立克氏病毒感染的细胞[10]。检测不同细胞或疾病状态下的lncRNA表达量有助于理解其功能、揭示其作用机理，并可作为疾病诊断的潜在标志物和治疗新靶点。

2 lncRNA与奶牛临床常见疾病

2.1 奶牛乳腺炎 奶牛乳腺炎是临床上奶牛常见疾病之一[11]，常常引起奶牛的产奶量降低，乳营养成分降低。尽管乳腺炎可治愈，但治愈后的奶牛产奶恢复缓慢，饲养成本增加，造成大量的经济损失。乳腺炎的病理机制至今尚未完全明确[12]，细菌感染、饲养管理不当、遗传因素等均可引起奶牛乳腺炎，临床上一般把大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为奶牛乳腺炎的重点防控病原菌[11]。奶牛乳腺炎发病机制复杂，临床上一般应用广谱抗生素进行治疗，但极易造成细菌耐药，不利于奶牛业的发展[13]。

奶牛乳腺炎的基本症状是患畜局部炎症，主要表现为乳汁异常，乳房不同程度的充血、增大、发硬、温热和疼痛。大量研究表明，lncRNA可在炎症中发挥重要作用，如lncRNA-NEAT1是炎症体激活的常见介质，可激活小鼠体内NLRP3、NLRC4和AIM2等炎性小体，增强它们的组装和随后的Caspase-1前加工，并进一步通过级联效应促进小鼠机体炎症反应[14]；lnc-IL7R可减轻脂多糖(LPS)诱导的炎症反应，敲除lnc-IL7R会增加IL-6和IL-8等炎性因子的释放[15]。与人和小鼠相比，奶牛相关的lncRNA研究还处于初始阶段，因此在基因水平上揭示奶牛乳腺炎复杂的致病机理的报道应运而生。

H19是人类发现的第一个lncRNA，全长2.3 kb[16]。研究发现，H19在胃癌、乳腺癌、口腔癌和胆管癌等多种肿瘤中都发挥重要作用，涉及PI3K/Akt、Wnt/β-catenin、NF-κB、JAK/STAT等多条经典致癌信号通路[17]。H19除了参与各种癌症的病理过程，其作为一种正向炎症调节因子，在NF-κB、p38/MAPK/mTOR、Toll样受体和TNF-α等典型炎症通路基因网络具有重要的调节作用[18]。因此猜测H19在牛乳腺上皮细胞的炎症反应中也起到一定作用。将H19转入牛乳腺上皮细胞(MAC-T)中发现，过表达H19通过促进炎症因子TNF-α、IL-6、CXCL2和CCL-5的表达，激活了NF-κB信号通路，从而影响LPS诱导的MAC-T细胞的免疫应答[19]。除了H19，XIST也是调节奶牛乳腺炎的重要分子。XIST是由雌性哺乳动物中失活的X染色体转录而来的一个长度为17 kb的lncRNA，其与H19的作用机理相似，不仅在人类的多种癌症中发挥重要的调节作用，并且与哺乳动物多种疾病的发生密切相关。马梦汝[12]研究发现，XIST可与NF-κB/NLRP3信号通路相互作用，抑制TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎性细胞因子的表达。

LncRNA在大动物方面的研究处于碎片化状态，缺乏系统的研究，相关数据库中lncRNA的注释不够全面，普遍缺乏系统和统一注释。西北农林科技大学高明清研究团队通过高通量测序等探究奶牛乳腺炎方面未注释的lncRNA，使用热灭活的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌处理MAC-T建立乳腺炎细胞模型，并通过高通量测序分析获得了正常细胞和乳腺炎模型细胞的lncRNA表达谱，鉴定出53个显著差异表达的lncRNA，发现了1个新的lncRNA，命名为lncRNA-TUB，并展开了一系列的研究；lncRNA-TUB参与了奶牛乳腺上皮细胞的增殖和迁移，β-酪蛋白分泌，炎性应答以及上皮细胞间质样转化等一系列生理病理过程，其可能作为免疫反应中炎症因子之间的重要元件发挥作用[11]。另一项研究发现，新鉴定的lncRNA，即LRRC75A-AS 1可影响紧密连接蛋白(Claudin-1、Occludin和ZO-1)的表达来调节细胞通透性及细菌侵袭和粘附能力，并通过NF-κB通路激活炎症应答[13]。与之相似，Mi等[20]通过高通量测序和KEGG通路富集分析发现PRANCR和TNK2-AS1这2个lncRNA广泛参与金黄色葡萄球菌攻击诱导的炎症反应。Tucker等[21]鉴定出NONBTAT027932.1和XR_003029725.1与奶牛乳腺炎免疫反应相关的多个候选基因相关联。PRANCR、TNK2-AS1、NONBTAT027932.1和XR_003029725.1可作为奶牛乳腺炎的疾病标志物和治疗干预位点，有进一步深入研究的价值。

综上所述，lncRNA可以在基因水平揭示奶牛乳腺炎复杂的致病机制，为奶牛乳腺炎临床早期预测提供潜在的标志物和治疗的有效靶点。

2.2 奶牛热应激 热应激会导致奶牛产奶量下降和临床疾病高发。以往对于奶牛热应激的研究多集中于微RNA(microRNA,miRNA)，如在热应激荷斯坦奶牛体内高表达的bta-miR-19a、bta-miR-19b和bta-miR-1246等可以作为诊断奶牛热应激状态的标志物[22]。Li等[23]通过RNA-seq技术发现，在热应激状态下差异表达的miRNA与Wnt、TGF-β、MAPK、Notch和JAK-STAT等信号通路的调控有关。随着高通量测序技术的推广和研究的深入，研究视线开始聚焦于lncRNA。Li等[24]率先通过RNA-seq技术检测并分析了热应激和非热应激奶牛乳腺中lncRNA表达谱，发现lncRNA TCONS_00023306、lncRNA TCONS_00005946和lncRNA TCONS_00102876等可能作为miRNA的初级转录本发挥作用，并提出了lncRNA和miRNA之间可能存在的深层次联系，为进一步研究lncRNA在奶牛中的作用机制提供了新思路。杨影[25]在LPS诱导的乳腺炎模型中应用RNA-seq筛选并鉴定得到34个差异表达的lncRNA，经GO富集分析和KEGG通路分析发现，这些差异表达的lncRNA涉及核苷酸切除修复、NF-κB信号通路、细胞粘附和免疫应答等多个生物学进程；在后续的lncRNA功能研究中发现，干扰lncRNA TCONS_00014079表达后能够显著降低TNF-α、IL-6和IL-8的表达，提示lncRNA TCONS_00014079参与了炎症反应和免疫应答。

综上所述，lncRNA在奶牛热应激中发挥重要的调节作用，并参与了免疫反应应答，为热应激导致的乳房炎的诊断和防治提供了新思路。

2.3 奶牛子宫内膜炎 奶牛子宫内膜炎也是奶牛临床常见疾病之一，会导致奶牛的屡配不孕、流产、胎间距上升和产奶量下降，致使奶牛的淘汰率上升，造成重大的经济损失。目前对子宫内膜炎的临床诊断主要依赖于产后阴道黏液检查，一旦检测指标异常便代表奶牛已发病。因此，将目光聚焦于高通量测序，筛选相关生物标志有助于疾病的监测、早期诊断和治疗。以往对于奶牛子宫内膜炎的研究大多聚焦在miRNA和差异基因，如Oladejo 等[26]发现miR-24-3p可通过靶向降低LGALS9基因的表达抑制促炎TLR4/NF-κB信号通路，从而调节奶牛的子宫内膜炎。随后他又发现miR-24-3p也可以通过靶向降低TRAF6基因来抑制NF-κB/MAPK信号通路，减轻奶牛子宫内膜的炎症[27]。miR-24-3p可能是子宫内膜炎的重要治疗靶点。Jiang等[28]通过miRNA芯片分析和相关试验得出，上调差异表达的miR-92b可通过激活PI3K/AKT/β-catenin途径抑制促炎TLR4/NF-κB信号通路，这项研究为奶牛子宫内膜炎提供了一种新的干预疗法。Jiang等[29]还发现miR-30a可通过抑制MyD88/NOX2/ROS激活的NF-κB途径发挥治疗奶牛子宫内膜炎的作用。

随着研究的深入，lncRNA在奶牛子宫内膜炎中的作用逐渐突显出来。李亚娟[30]对发病或未发病的奶牛子宫病料进行高通量测序，揭示了奶牛子宫内膜组织中lncRNA表达谱，共检测到6 201个差异表达的lncRNA，对其进行功能富集发现，差异表达的lncRNA参与先天性免疫调节、细菌粘附等生物学进程的调节，KEGG分析发现，差异表达的lncRNA参与cAMP信号通路、PPAR信号通路等。而Sheybani等[31]应用加权基因共表达网络(WGCNA)方法对奶牛子宫内膜炎中的mRNA、lncRNA和miRNA的互作进行网络整合。这种方法以网络中高度连接的基因(Hub)为中心，有利于剔除冗余数据，更精确锁定后续研究目标。如BTA-miR-449a和BTA-miR-449b这2个miRNA靶向Hub-Hub lncRNA ENSBTAG00000049936,已有研究证明miR-449a和miR-449b-3p在炎症中起一定的调节作用[32,33]。因此，lncRNA ENSBTAG00000049936可能是导致奶牛子宫内膜炎进展的潜在基因，可被视为奶牛子宫内膜炎的生物标志物和治疗靶点进行后续研究。

综上所述，ncRNA在奶牛子宫内膜炎领域的研究以miRNA为主，lncRNA的研究相对较少。针对奶牛乳腺炎相关的lncRNA进行研究既可以填补该领域的研究空缺，又有助于进一步阐明奶牛子宫内膜炎的潜在机制，是有价值的研究路线。

2.4 奶牛副结核 奶牛副结核(Johne's disease,JD)是由禽副结核分枝杆菌亚种(Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis,MAP)引起的反刍动物的一种慢性肉芽肿性肠道感染副结核病，是一种慢性消耗性疾病，会导致病牛体重减轻、腹泻和产奶量逐渐下降，最终导致死亡。JD是一种多因素感染病，病牛在达到临床阶段之前不会出现任何症状，只有在临床阶段才能检测到这种感染[34]，并且其病原学和潜在的分子机制尚未完全阐明。因此，识别与这种感染相关的关键基因和途径可能是预防临床感染发病的有效途径。

Gupta等[35]分析了来自MAP感染和未感染的原代牛巨噬细胞的高通量RNA-Seq数据，结果显示，在JD感染中差异表达的lncRNA可以调控TNIP3、TNFAIP3和NF-κB2等基因的表达，影响TNF、NF-κB和TLR等与免疫反应相关的信号通路；在JD感染组中随机选择3个lncRNA，用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法分析其表达，结果显示，XLOC_000633表达极显著上调，XLOC_030080和XLOC_029370表达显著上调，表明这3个lncRNA可以作为检测受感染动物的潜在生物标志物，但还有待于进一步研究。以往对JD的研究一般使用体外感染的奶牛巨噬细胞鉴定lncRNA，但外源血清会影响巨噬细胞的极化，导致测序结果不准确，故Marete等[36]应用RNA-seq技术检测自然状态下JD阳性奶牛巨噬细胞中的lncRNA，发现了605个差异表达的新lncRNA，其可以调控包括CCDC174、ERI1、FZD1、TWSG1、ZBTB38、ZNF814和ZSCAN4共7个基因的表达，影响奶牛自身的免疫调节和MAP的感染。Heidari等[37]从NCBI的GEO数据库中下载JD相关数据，使用WGCNA方法构建了完整的调控网络，可以更全面地了解MAP感染的分子机制，该研究鉴定了hub和hub-hub基因以及未保存的模块中的TF和lncRNA后，构建了lncRNA-mRNA-TF整合网络，鉴定出47个新的lncRNA，其中有21个与免疫系统和MAP感染相关；其中被鉴定为hub-hub基因的lncRNA ENSBTAG00000052980、lncRNA ENSBTAG00000049459、lncRNA ENSBTAG00000049459、lncRNA ENSBTAG00000053153和lncRNA ENSBTAG00000050877可能成为诊断MAP感染的生物标志物。

3 展望

近年来随着新一代测序技术的发展，lncRNA已经成为生命科学领域的研究热点。哺乳动物的lncRNA除了与机体的炎症和获得性免疫有关外，还参与病毒感染后的天然免疫调节。与人和鼠的基因组相比，家畜的lncRNA的基因组注释仍然非常稀少，随着研究的不断深入，会有更多新的lncRNA转录本，但lncRNA调控的复杂性以及研究的相对困难性，导致对lncRNA生物学功能的认识和研究不够深入全面，尤其是在奶牛临床疾病方面，大多数的研究仅停留在寻找具有特殊作用的lncRNA或作为某种疾病的潜在标志物，尚缺乏系统全面的研究。近年出现了一种基于WGCNA网络的互作网络整合方法。尽管WGCNA网络对mRNA、lncRNA和miRNA的互作整合有助于理解疾病发生中的功能网络通路，但这种研究方法只考虑了高度关联的基因(中枢和中枢-中枢)的网络关键部分，缺乏实际试验的验证。相信随着新一代测序技术的不断发展和相关研究的不断深入，可以在这2种类型的研究方法中找到一个平衡点，在精准把控疾病的生物学标志基础上，全面深入理解奶牛临床常见疾病的病原学和潜在的分子机制，为我国畜牧兽医事业的发展提供保障。