葛小琴 赵菁 叶晓贤 沈虹

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，每年全球新诊断病例超过200 万[1]，三阴性乳腺癌是乳腺癌中侵袭性最强的类型，一旦发生转移，患者预后很差。全身化疗是治疗晚期三阴性乳腺癌患者主要手段。紫杉类联合蒽环类（taxane-anthracycline，AT）药物是治疗乳腺癌最主要化疗药物，其中紫杉类药物以紫杉醇和多西他赛为代表，在转移性乳腺癌的一线和二线治疗中显示出重要作用[2-4]。其他可选的化疗药物包括吉西他滨、长春瑞宾、铂类等。然而，化疗是经验性用药，并非所有患者都能从中受益。目前，临床上未有明确的标志物可用来预测化疗疗效。因此，如能找到合适的预测手段，在化疗前就能将对某一种化疗方案受益的人群筛选出来，进行个体化治疗，这将有益于患者的治疗及预后。表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱（surface-enhanced laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）是一种基于化学修饰表面捕获肽或/和蛋白质的新技术，可有效分析复杂的生物样品，结合生物信息学方法，SELDITOF-MS 发现了几种对癌症诊断和治疗具有高灵敏度和特异度的标志物[5-8]。本研究使用SELDI-TOF-MS技术比较晚期三阴性乳腺癌患者中经一线AT 治疗的化疗受益者和无效者的血清蛋白质质谱数据，结合人工神经网络（artificial neural networks，ANN），初步建立血清蛋白质指纹图谱晚期三阴性乳腺癌化疗疗效的预测模型，以期为化疗前筛选出对AT 方案有效的转移性乳腺癌患者提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料 收集的26 份血清标本保存于浙江大学肿瘤研究所血清库，患者为2015年8月至2018年7月浙江大学医学院附属第二医院收治的三阴性转移性乳腺癌患者。纳入标准：组织学诊断为三阴性乳腺癌；未经化疗；至少有1 个可测量的转移性病灶；年龄18～75 岁；WHO 体能状态评分为0 或1。排除标准：心功能不全患者及预计生存期＜3 个月。患者首次化疗空腹采集静脉血，1 000 r/min 离心2 min 分离血清，储存在-80℃冰箱备用。本研究经浙江大学医学院附属第二医院人体研究伦理委员会审核[审批号：（2022）伦审研第（0528）号]，所有患者签署知情同意书。

1.2 化疗方案 所有患者均采用AT 方案作为一线化疗。AT 方案包括多柔比星（美国辉瑞，规格：10 mg）50 mg/m2静脉推注加多西他赛（法国赛诺菲，规格：20 mg）75 mg/m2静脉滴注1 h，每3 周给药1 次，共2 个周期。疗效评价：根据实体瘤疗效评价标准（response evaluation criteria in solid tumors 1.1，RECIST 1.1），每2个化疗周期评估疗效。使用观察到的最佳反应将患者分为两组。化疗受益（responders，R）组包括完全缓解（complete response，CR）和部分缓解（partial response，PR）患者，化疗无效（non-responders，NR）组包括疾病稳定（stable disease，SD）和疾病进展（progressive disease，PD）患者。

1.3 蛋白质峰的检测与收集 使用SELDI-TOF-MS检测。取血清标本10 μl 加入到90 μl 的5 g/L 的3-环乙胺-1 丙磺酸（3-cholamidopropyl dimethylammonio-1-propanesulfonate，CHAPS）中，调整pH 7.4，振荡10 min使之充分混合，加入到用5 g/L CHAPS 平衡3 次的100 μl Cibacron Blue 3GA 溶液中，转移至96 孔细胞培养板，4 ℃摇床上振荡1 h。取出培养液1 000 r/min 离心，去上清液，用150 μl 20 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸[4-（2-hydroxyerhyl）piperazine-1-erhanesulfonic acid，HEPES，pH 7.4]稀释。使用包含疏水表面（H4）芯片的生物处理器，其芯片先前由20 mmol/L HEPES 激活。将培养液转移至生物处理器密封平台摇床上，4 ℃振荡1 h。弃去上清液，平台摇床上以700 r/min 振荡5 min，取出芯片用20 mmol/L HEPES（pH 7.4）洗涤3次。晾干芯片，加入氰基-4-羟基肉桂酸（acyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA）结晶，使用蛋白质生物系统II 和质谱仪读取器以65 次激光射击收集数据，强度为165，探测器灵敏度为7，最高质量为60 000 m/z，优化收集数据范围2 000～30 000 m/z。使用全合一肽分子质量标准仪将质量准确度校准到＜0.1%。所有样品的光谱均归一化为2 000～30 000 m/z 的总离子电流。滤除噪声，并使用自动峰检测通道检测峰。采用第二次通过峰选择（信噪比＞2，在0.3% 质量窗口内）完成峰簇，添加估计峰值。使用ProteinChip Software 3.2 和Biomarker Wizard 3.1 软件执行数据的收集步骤。使用ANN 分析收集到的蛋白质峰。所有计算均使用Statistica6.0（StatSoft，Inc.，Tulsa，OK）软件包进行。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0 统计软件，非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用Mann-Whitney U 检验。采用ROC 曲线分析蛋白质峰的评价效能。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 化疗疗效统计 经2 个周期治疗后，26 例患者17例（65.4%）有效，9例（34.6%）无效。

2.2 蛋白质峰分析 共检测到223个质荷比为2 000～30 000 m/z的蛋白质峰，可能作为AT方案治疗转移性乳腺癌患者疗效预测的潜在标志物。经ROC曲线排序，选择AUC最大的5个峰作为候选生物标志物。血清蛋白质荷比分别为16 031、6 098、15 931、6 916 和4 773 m/z，见图1（插页）。相比无效组，有效组中4 773 m/z 蛋白质峰显著升高，16 031、6 098、15 931 和6 916 m/z 峰显著降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。利用这5 个峰建立用于预测AT 方案治疗转移性乳腺癌疗效的预测模型。将样本随机分为训练组和测试组，交叉验证显示，化疗受益者组17 例样本均被准确预测，化疗无效组9 例样本中8 例被准确预测，该预测模型预测化疗疗效灵敏度达1.000（17/17），特异度达0.889（8/9），见表2。

表1 两组患者5 个蛋白质峰比较

表2 乳腺癌化疗疗效预测模型的验证结果（例）

图1 AT方案治疗两组晚期乳腺癌患者的蛋白质峰

3 讨论

临床发现，转移性乳腺癌的治疗过程中，有大约一半的患者出现耐药性。事实上转移性肿瘤在初始治疗中获得最大反应对提高整体治疗成功率至关重要，这显示化疗药物疗效预测标志物的重要性。

SELDI-TOF-MS蛋白质芯片技术可用于乳腺癌的诊断、鉴别诊断、预后评估及术后复发转移监测等。Sun 等[9]通过SELDI-TOF-MS技术分析发现，相比于健康人群，乳腺癌患者外周血中蛋白质峰在6 448 m/z 处表达显著降低，尤其是三阴乳腺癌中表达强度明显减弱，提示6 448 m/z 的蛋白质峰可能是一种潜在的诊断标志物。Yigitbasi 等[10]使用SELDI-TOF-MS技术鉴定了4 个在乳腺癌患者和非癌症患者间存在明显差异的蛋白质峰群，所鉴定的蛋白质峰（分别为3 972、6 850、8 115、8 949 m/z）可与癌抗原125 选择性结合，作为诊断乳腺癌的重要生物标志物。Chung 等[11]用蛋白质芯片质谱法发现并确立了由5 种血清蛋白组成的预测模型，区分乳腺癌患者和人群的灵敏度为0.866，特异度为0.924；该模型与肿瘤大小和淋巴结受累相关，有助于判断乳腺癌的预后，尤其是雌激素受体（esrtogen receptor，ER）阴性的乳腺癌。Gmez-Pozo[12]等在对乳腺癌患者术后辅助化疗的研究中发现高通量蛋白组学可用于识别三阴性乳腺癌中具有不同预后的亚组，可通过多种蛋白质组合，实现对不同分期患者的分层预测，如蛋白质RAC2、RAB6A、BIEA 和IPYP 组成的最佳预测因子，可有效预测患者病情，并对医师治疗起指导和参考作用。Lei 等[6]发现3 964 m/z 蛋白质峰在乳腺癌术后下降，复发后又回升，可作为监测乳腺癌早期复发的标志物。以上研究在乳腺癌诊断、复发监测和预后评估中都体现了较好的预测效能。

目前通过乳腺癌化疗疗效预测的血清蛋白质指纹图谱模型研究较为罕见。王栋梁等[13]使用基质辅助雷射解吸电离飞行时间质谱技术从乳腺癌MMTVPyMT 转基因小鼠中筛选出5 个差异最大的分子峰，并建立紫杉醇耐药预测模型。Zhang 等[14]使用SELDITOF-MS 发现新辅助化疗后有8 个不同血清蛋白质峰的强度高于新辅助化疗前。郑弘宇等[15]通过SELDITOF-MS 技术检测了乳腺癌患者治疗前外周血中蛋白质峰，结果发现7 971、9 284 m/z 处峰值降低的乳腺癌患者可能对曲妥珠单抗治疗耐药。He 等[16]利用SELDI-TOF-MS 技术分析新辅助化疗前乳腺癌组织的蛋白组学，结果发现16 906 m/z 处的蛋白质峰能正确鉴别出88.9%的病理完全反应的肿瘤和91.7%耐药肿瘤。提示使用乳腺癌蛋白质生物标志物可预先区分化疗受益人群，并由此指导不同患者选择最佳的化学治疗。Shenoy 等[17]通过蛋白组学研究发现了两个脯氨酸生物合成途径的蛋白吡咯啉-5-羧酸还原酶（pyrroline-5-carboxylate reductase 1，PYCR1）和ALDH18A1，与化疗的耐药性显著相关，其中PYCR1 在治疗后完全应答者中明显下调，而在非应答者中则没有改变。Yang 等[18]通过质谱分析及免疫组化方法发现FK506 结合蛋白4（FK 506 binding protein 4，FKBP4）、S-100A9可能是阿霉素联合多西他赛治疗乳腺癌化疗灵敏度的预测标志。

本研究使用SELDI-TOF-MS 蛋白质芯片技术发现化疗收益组和无效组中血清蛋白质峰的差异，并使用ANN 分析这些峰值，最终建立预测AT 方案疗效的蛋白质模型，灵敏度和特异度分别为1.000 和0.889。今后研究可重点关注这些蛋白质或多肽的鉴定与分离。如果能清楚地阐明它们的分子结构及功能，它们在预测化疗疗效方面的应用潜力将显著提高，并为转移性乳腺癌的治疗提供新的见解，即将这种蛋白质模型作为决策工具，优先筛选出能从一线化疗中获益的转移性乳腺癌患者。

综上所述，SELDI-TOF-MS 技术与生物信息学工具及ANN 相结合可促进新的标志物的发现。本研究筛选出能预测转移性乳腺癌化疗疗效相关的标志蛋白，建立高灵敏度和特异度的预测模型，为肿瘤个体化治疗提供了新的方法。