苑建伟，崔梦娇，侯小歌，梁晨晨

1.周口职业技术学院农牧工程学院（周口 466000）；2.周口师范学院生命科学与农学学院（周口 466000）

放线菌是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强大的原核生物，其代表属有链霉菌属、诺卡氏菌属、放线菌属等[1]，被广泛应用于抗生素、各种酶制剂、有机酸和维生素等的生产，同时也应用于烃类发酵、石油脱蜡和污水处理等方面，但有些放线菌会对人类构成危害[2]。

大曲作为中国浓香型白酒的主要糖化发酵剂，富含酵母菌、细菌、霉菌和放线菌，放线菌作为白酒酿造微生物中的一类，在培曲和糟醅发酵过程中可产生纤维素酶，破坏谷物细胞壁，利于淀粉释放，提高淀粉的利用率[3]。同时大多放线菌可产生大量次级代谢产物，尤其是抗生素，对多种菌种均有抑制作用，因此大曲中放线菌的种群结构和功能特性直接影响大曲的质量，进而影响浓香型白酒的产量和品质[4]。近年来，对白酒酿造过程中放线菌的研究主要集中在其对白酒风味的影响及发酵过程中对其他菌群的抑制作用[5-6]。

宋河白酒作为豫东地区的典型代表，对其酿酒微生物的研究已有不少报道，但是对白酒中放线菌的研究较少。以宋河大曲为原料，对放线菌进行分离鉴定，并对其中典型的放线菌与宋河大曲其他主要菌株的相互作用进行初步探索，以期对改善白酒风味、放线菌的利用与开发提供方法和理论参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

高氏一号培养基[7]、糖发酵基础培养基[8]、淀粉培养基[9]、明胶培养基[10]、硝酸盐培养基[11]、指示红曲霉菌培养基[12]、指示酵母菌培养基[13]、指示芽孢菌培养基[14]（所有培养基经121 ℃、0.1 MPa高温高压灭菌20 min待用）。

电子天平（型号AL204），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司生产；超净工作台（型号JJ-CJ-2FD），苏州市金净净化设备科技有限公司生产；恒温培养箱（型号DHP-9162），上海一恒科学仪器有限公司生产；灭菌锅（型号SYQ-PSX-280B），上海申安医疗器械厂生产；可见分光光度计（型号V-5000），上海元析仪器有限公司生产；等。

1.2 放线菌的分离

将大曲粉碎，在无菌条件下取10 g粉碎样品加入90 mL无菌水，摇床振荡30 min后静置，做梯度稀释。取10-2，10-3和10-4梯度进行涂布平板，于30 ℃倒置培养5～7 d，在高氏一号培养基中筛选数量优势放线菌和具有明显特征的放线菌单菌落分别纯化后低温保藏备用[15]。

1.3 放线菌形态学和生理生化特性鉴定

1.3.1 形态学观察

主要包括菌落特征和湿室培养的显微镜细胞观察[16]。

1.3.2 生理生化特性试验

1.3.2.1 过氧化氢酶试验

将放线菌接种于基础培养基上于28 ℃培养5 d。取清洁的载玻片，在载玻片上滴1滴3% H2O2，挑取1环菌丝，在H2O2溶液中涂抹，5 min内观察是否有气泡产生[17]。

1.3.2.2 耐盐试验

在高氏一号培养基中分别加入3%，5%和8% NaCl配制成耐盐培养基，将待测菌丝接种到耐盐培养基上，28 ℃培养7 d，以未添加NaCl的高氏一号培养基为对照，观察放线菌生长情况[17]。

1.3.2.3 生长温度试验

将分离得到的放线菌各接种4个平板，分别在30，34，37和42 ℃条件下培养7 d，观察对比放线菌的生长情况[17]。

1.3.2.4 硝酸盐还原试验

将1环菌丝接种于还原硝酸盐培养基中，在30 ℃培养7 d后，分别加入硝酸盐还原试剂甲液和乙液各2滴[17]。

1.3.2.5 淀粉水解试验

用点种法将菌种接种在淀粉琼脂培养皿上，于30℃培养7 d，在菌落周围滴加1～2滴碘液，观察试验现象[17]。

1.3.2.6 明胶液化试验

在高氏一号培养基中加入1%明胶，倾注平板。将平板分区分别点种，培养5 d，在菌落上滴加Frazier试剂，10～20 min后观察菌体周围是否出现透明圈[17]。

1.3.2.7 糖发酵试验

制备果糖、葡萄糖、麦芽糖液体培养基，分装到不同的试管中，将1环放线菌接种到3种液体培养基中，并在试管内放入杜氏小管，在30 ℃培养5～7 d，观察液体是否变红，杜氏小管中是否有气泡，确定放线菌对糖醇的利用情况[17]。

1.3.2.8 Voges Proskauer（VP）试验

吸取2滴0.5%肌酸溶液注入洁净小试管中，取1环放线菌菌丝接种。加入3滴5%α-萘酚，2滴40% KOH溶液，振荡后放置5 min，观察颜色是否变化[17]。

1.4 典型混菌作用研究

1.4.1 放线菌对大曲酒曲优势菌生长的抑制作用

制备放线菌菌悬液，使用不含琼脂的高氏一号培养基按5%接种量接种放线菌，在28 ℃条件下，摇床培养7～10 d。

分别挑取大曲数量优势芽孢菌Sp1、Spm1、Spm2，耐高温酵母菌Y1、Y2，以及10环红曲霉菌菌苔，加入到20 mL无菌水中，摇匀，制备菌悬液，依次按10倍梯度稀释。取1 mL合适稀释度的菌悬液涂布在酵母菌指示平板上，分别做好标记。用镊子夹住直径约1 cm的无菌圆滤纸片，蘸取少许放线菌发酵液，贴到有各指示菌平板上，每个平板上贴3～4片，在30 ℃条件下培养3 d，观察是否出现抑菌圈，如果出现抑菌圈，精确测量各个抑制圈直径（R/cm），并计算抑制圈直径与滤纸片的直径（r/cm）的差值（R-r/cm）。通过比较差值大小，分析放线菌典型抑菌活性。

1.4.2 放线菌对大曲典型菌株的混合发酵作用

分别挑取10环芽孢菌、酵母菌、红曲霉菌，加入到20 mL无菌水中，摇匀，制备菌悬液，依次10倍梯度稀释。按2%接种量，分别将芽孢菌Sp1、Spm1、Spm2，酵母菌Y1、Y2及红曲霉菌这6种菌的种子液接入液态基本培养基中，按接种量1%接入放线菌。未接种放线菌的为空白对照，做2组平行试验，在28 ℃条件下摇床培养5～7 d。

采用分光光度和标准曲线法测定淀粉酶活力，采用蒸馏法和酒精计测定法测定其产酒力，采用滴定法测定酯化酶活力[18]。

2 结果与分析

2.1 放线菌的分离鉴定

从宋河高温大曲中共分离纯化到5株放线菌，分别编号为F1、F2、F3、FM、Fh，菌株的典型菌落特征和镜检特征如图1所示。

图1 放线菌的菌落特征和镜检特征

分离得到的各种放线菌的生理生化特性如表1所示。放线菌F1、F2、F3、Fh、FM均能利用葡萄糖、麦芽糖和果糖，明胶液化及VP试验均为阳性，均不能使硝酸盐还原；F2、Fh含有过氧化氢酶，F1、F3、FM不含过氧化氢酶；F1、F2能使淀粉水解，F3、Fh、FM不能使淀粉水解。根据温度生长情况可知：F1、F2、F3、FM为中温菌，Fh为中高温菌；F1、F2耐盐性较强，F3耐盐性一般，FM、Fh耐盐性较弱。

综合图1和表1可知：菌株F1、F3、Fh、FM这4株放线菌形态基本上相同，生理生化特征也基本相似，参照《微生物分类学》《链霉葛鉴定手册》[19-20]，F1、F3、Fh、FM这4株放线菌基本上都符合放线菌链霉菌属的特征，F2基本符合放线菌拟诺卡菌属的特征，故初步鉴定放线菌F1、F3、Fh、FM为链霉菌属，F2为拟诺卡菌属。

表1 放线菌的生理生化特性

2.2 放线菌与大曲典型菌株的混菌作用

2.2.1 放线菌对大曲典型菌株生长的抑制作用

放线菌F1对大曲3类典型菌株的抑菌情况如表2所示。菌株F1对酵母菌Y1、Y2的生长抑制作用较大，对芽孢菌Spm1、Spm2的抑菌作用较小，对芽孢菌Sp1、红曲霉菌没有抑制作用。由此可知，放线菌F1并不影响芽孢菌Sp1、红曲霉菌的生长，但不能与酵母菌Y1、Y2混合生长，在糟醅发酵过程中不利于产酒。

表2 菌株F1抑菌情况 单位：cm

放线菌F2的抑菌情况如表3所示。菌株F2对芽孢菌Spm2的生长有抑菌作用，对其他2株芽孢菌没有抑菌作用，对酵母菌Y1、Y2的生长也有抑菌作用，对红曲霉菌的生长没有抑菌作用。由此可知，放线菌F2对部分芽孢菌生长有抑制，对酵母菌抑制能力低于放线菌株F1，在白酒生产上可以加以利用。

表3 菌株F2抑菌情况 单位：cm

放线菌F3的抑菌情况如表4所示。菌株F3对酵母菌Y2生长抑制作用非常明显，对酵母菌Y1、芽孢菌Spm2也有抑制作用，对其他菌株没有抑制作用。由此可知，菌株F3对酵母菌抑制作用强，不利于白酒生产。

表4 菌株F3抑菌情况 单位：cm

菌株FM的抑菌情况如表5所示。放线菌FM对所有菌都有抑制作用，对红曲霉菌的抑制作用最强，对其他菌株的生长也有不同程度的抑制作用，不利于培曲和糟醅发酵。

表5 菌株FM抑菌情况 单位：cm

菌株Fh的抑菌情况如表6所示。菌株Fh对酵母菌Y2、Y1和芽孢菌Spm1、Spm2也有抑制作用，对芽孢菌Sp1、红曲霉菌并没有抑制作用。

表6 菌株Fh抑菌情况 单位：cm

在大曲培养和糟醅发酵过程中，放线菌与其他菌株混杂生长，芽孢菌Sp1和红曲霉菌分别作为大曲数量优势菌和重要的功能性菌株，除放线菌株FM外，其他放线菌并不影响其生长，但5株放线菌均能抑制酵母菌的生长，因此放线菌对制曲影响不大，但不利于糟醅发酵。

2.2.2 放线菌与大曲典型菌株的液态发酵作用

2.2.2.1 放线菌对优势芽孢菌产淀粉酶能力的影响

由表7可知：除放线菌Fh使芽孢菌Sp1，放线菌F2、F3、Fh使芽孢菌Spm1产淀粉酶能力增强外，其余放线菌对芽孢菌的产酶能力的影响均表现为抑制，但是抑制效果并不明显，所以在液体发酵过程中放线菌对芽孢菌的产淀粉酶能力并不明显，并且可以利用放线菌Fh提高芽孢菌Sp1的产淀粉酶能力。

图2 淀粉标准曲线图

表7 放线菌对芽孢菌产淀粉酶能力的影响单位：U/mL

2.2.2.2 放线菌对大曲红曲霉菌产酯化酶能力的影响由表8可知：放线菌F1使红曲霉菌的产酯化酶能力升高，菌株F2、Fh和FM使红曲霉菌产酯化酶能力降低，但并不明显，菌株F3对红曲霉产酯化酶能力没有影响。由此可知，在白酒生产过程中合理利用菌株F3能使红曲霉菌产酯化酶能力提高，达到提高白酒品质的目的。

表8 放线菌对酒曲优势红曲霉菌产酯化酶能力的影响单位：U/mL

3 结论

通过以宋河大曲为试验材料分离放线菌并对其进行初步鉴定，分离得到5种放线菌F1、F2、F3、Fh、FM，其中F1、F3、Fh、FM为放线菌链霉菌属，F2为拟诺卡氏菌属。

分别采用抑菌片法和液态发酵法考察放线菌对大曲优势菌生长抑制和相互作用，5株放线菌均抑制大曲酵母菌的生长但并不抑制其产酒力，除放线菌株FM外，其他4株不抑制大曲优势芽孢菌Sp1和红曲霉的生长，5株放线菌均不同程度地抑制芽孢菌Spm1和Spm2的生长和产淀粉酶能力，但影响并不大。放线菌F1使红曲霉菌的产酯化酶能力升高，其余4株并不影响其产酶。