高善行，张瑞祎，王毓甜，李景明，臧佳辰*

中国农业大学食品科学与营养工程学院（北京 100083）

石榴（Punica granatumL.），石榴科石榴属植物，酸甜可口，具有丰富的氨基酸、维生素、纤维素、矿物质等营养物质[1]。目前中国的石榴栽种面积约170万亩（1亩≈666.67 m2），居世界首位，年产量100万 t以上[2]。如今品种丰富多样的鲜食石榴、果汁、果酒、石榴籽油等相关产品，均展示了石榴及其综合产业的迅速发展。

但在石榴的加工过程中，约占石榴质量30%的石榴皮[3]，仅仅作为饲料或肥料被简单处理，或被直接丢弃，造成了较大的浪费[4-5]。通过对化学成分的分析，石榴皮富含多酚、丹宁、鞣质、黄酮、有机酸等重要活性物质[6-7]，其中多酚约占石榴皮干重的10%～20%[8]，包括安石榴苷、鞣花酸、没食子酸、儿茶素、绿原酸等多种物质[9-10]，开发价值巨大。

石榴皮多酚的抗氧化活性可超过大部分植物[11-12]，已得到了大量体内与体外试验的验证。通过对自由基的清除，石榴皮多酚能够有效阻止其对组织和器官的破坏作用，有助于提高食品的安全性与品质，为进一步开发天然食品添加剂提供了理论依据和思考。

然而，因多酚类化合物性质较不稳定，易被氧化破坏，因此提取时间过长、温度过高都有可能导致石榴皮多酚的损失[13]，不仅增加生产成本，还会降低石榴皮多酚抗氧化等活性。因此，不断改进石榴皮多酚的生产工艺，提高提取效率势在必行。

超声波提取是一种新兴的提取方法，因其提取时间短、效率高等特点，逐渐被应用到植物活性物质（如多酚）的提取当中，也是一种提取石榴皮多酚的重要途径[14-15]。已有研究证明，在超声波提取过程中，能够省去加热的工艺，并且极大节省了提取时间[16]。与此同时，酶的使用可以在前处理过程中温和、高效地获取多酚原料，避免极端条件破坏多酚结构，影响其功能活性。因此，试验将联合酶法和超声法进一步优化石榴皮多酚提取工艺。

综上所述，石榴皮多酚的功能活性非常丰富，具有相当广阔的应用前景，因此可以进一步改进石榴皮多酚提取方法，提高石榴皮多酚的提取效率，以推动相关产业的应用和发展。研究通过单因素试验和正交试验，以复合酶解、溶剂提取、超声波辅助提取的方式，改良现有提取石榴皮多酚的方法。同时，试验重点测定了不同提取方案中石榴皮多酚对于自由基的清除活性，对主要活性物质作定性与定量分析。

1 材料与方法

1.1 材料

石榴皮：由市售石榴获得，取果皮淡黄色部分，通过清洗、破碎、干燥等程序，在低温条件下备用。

1.2 仪器及试剂

HW.W21.600C电热恒温水浴锅（北京长风仪器仪表公司）；CF16RN高速冷冻离心机（日本日立公司）；DZF-6213电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；Cary-50紫外可见分光光度计（美国Varian公司）；2000D超纯水器（北京长风仪器仪表公司）；KQ2200DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Venusil MP-C18液相色谱柱（天津博纳艾杰尔科技有限公司）；LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津公司）。

纤维素酶、果胶酶（北京Solarbio公司）；无水碳酸钠、无水乙醇、没食子酸（北京化学试剂有限公司）；Folin-Ciocalteu试剂（美国Sigma公司）；DPPH（上海阿拉丁生化科技）；没食子酸、安石榴苷、儿茶素、鞣花酸（HPLC≥98%，Solarbio）。

1.3 方法

1.3.1 复合酶辅助提取

复合酶提取方法在王华斌等[17]的研究基础上优化得出。准确称取1.00 g石榴皮粉末于50 mL离心管中，按照1∶20 g/mL的料液比，加入20 mL质量浓度为0.2 mg/mL的酶溶液，混匀后在40 ℃下水浴保温40 min，在3 000 r/min下离心10 min，分离上清液备用，在95℃下加热10 min以灭活酶，沉淀用于下一步提取。

在相同总质量浓度下，设置不同比例的纤维素酶与果胶酶，配制复合酶溶液。检测不同复合酶条件下，酶解所得石榴皮多酚产率和抗氧化活性，以得到最适宜提取的复合酶比例。

1.3.2 超声波-有机溶剂联合提取单因素试验

在1.3.1小节的沉淀中加入20 mL体积分数为30%，40%，50%，60%和70%的乙醇溶液，料液比选取1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30（g/mL），混匀后，在100 W超声波，30，40，50，60和70 ℃水浴温度下提取5，10，15，20和25 min。在3 000 r/min下离心10 min，弃去沉淀，将上清液与1.3.1小节中的上清液合并后于遮光条件下保存，得到石榴皮多酚提取液。每个水平重复试验3次取平均值。

1.3.3 正交试验

依据单因素试验结果，选取乙醇体积分数、料液比、提取温度、提取时间各3个水平进行正交试验以筛选最佳反应条件。

1.3.4 石榴皮多酚的总酚含量测定

试验在周帆等[18]的测定方法上稍作改进，采用Folin-Ciocalteu法测定。将样品提取液稀释10倍，用移液器量取5 μL，加入195 μL蒸馏水，加入200 μL Folin试剂，再加入600 μL 15%的Na2CO3溶液，混匀后，避光反应30 min。以标准曲线的空白对照作为样品溶液的空白对照，测定波长760 nm下样品溶液的吸光度。每个样品平行测定3次，取平均值，用标准曲线的回归方程按式（1）计算提取液中的酚类含量（mg GAE/g DW）。

式中：GAE为没食子酸当量，DW为干重。

1.3.5 DPPH自由基清除率的测定

石榴皮多酚清除DPPH自由基的清除率在邓娜等[19]方法基础上改进。用无水乙醇将石榴皮提取液稀释至原来浓度的0.01倍，取500 μL稀释后的样品溶液，加入500 μL 0.1 mmol/L的DPPH自由基溶液混匀后静置，避光30 min，波长516 nm下测定各溶液的吸光度，记为Ai；以相同体积的无水乙醇代替DPPH自由基溶液作为空白，记为A0；相同体积无水乙醇代替样品溶液作为对照，记为A1。所有样品平行测定3次，取平均值。按式（2）计算石榴皮多酚对DPPH自由基的清除能力。

1.3.6 数据分析

应用SPSS 20.0软件对单因素试验和正交试验的质构数据分别进行方差分析（S-N-K法）和直观分析，确定各因素合适的试验水平数和最佳的提取多酚条件。

1.3.7 HPLC法鉴定

取1.3.4小节中抗氧化活性最高，最低与中等的样品，用甲醇稀释10倍后，过0.22 μm有机膜备用。色谱测定参数见表1。

在使用前预先对流动相过0.45 μm有机膜，超声脱气30 min备用。同时对液相色谱设备及管路进行脱气。使用甲醇冲洗管路，将检测器波长调节至280 nm，预热30 min。

设置所需梯度洗脱程序，进样各混合标准品溶液与样品溶液，每个标准品及样品重复进样3次，记录其对应的保留时间及峰面积，以保留时间（min）为横坐标，峰面积为纵坐标，由此可绘制得到四种标准品的液相标准曲线；对样品溶液进行检测，可计算得出以上四种成分的含量。

2 结果与分析

2.1 不同酶种类对提取效果的影响

根据酶反应高度专一性的特点，试验使用不同种类酶（纤维素酶、果胶酶、不同比例复配的纤维素酶-果胶酶复合酶），水解原料中的细胞壁组分，破坏细胞结构，使植物多酚等有效成分更易溶进溶剂中，将活性物质释放，达到提取的目的。在其他因素（温度、提取时间等）均相同的条件下，按照1.3.2小节所示步骤，进行复合酶解辅助提取。在测定总酚含量与DPPH自由基清除能力后，可得不同酶的种类对提取效果的影响，如表2所示。

表2 不同复合酶的酶解效果

通过不同酶种类对提取效果的初步试验，选择W纤维素酶∶W果胶酶=1∶2的复合酶进行后续单因素试验及正交试验，在此条件下酶解并提取，可得相对较高的总酚含量与自由基清除率。

2.2 影响石榴皮多酚提取的条件确定及DPPH抗氧化分析

2.2.1 乙醇体积分数确定

由图1可知，过高或过低的乙醇体积分数下石榴皮多酚的得率与抗氧化能力均较低，可能由于过高的乙醇体积分数，溶剂与石榴皮多酚的极性差异较大，溶解度下降。而过低体积分数的乙醇破坏多酚类物质与糖类、蛋白质氢键及疏水键能力较弱，从而提取效果不佳。

图1 不同乙醇体积分数下总酚含量与自由基清除率

相较而言，40%左右的乙醇体积分数作为溶剂，与石榴皮中酚类物质极性相近，因此可以较好地溶出石榴皮多酚等活性成分，多酚含量达167.58 mg GAE/g DW，此时自由基清除率可达28.74%，与先前研究中提取效果较好的结论相符[20]，亦与前人报道一致[21]。

综合各项参数，选取40%作为标准，30%，40%和50%为较合适的乙醇体积分数试验水平。

2.2.2 料液比确定

从图2可看出，随着液体占比不断增大，总酚含量与自由基清除率也在不断升高，料液比在1∶10～1∶25（g/mL），总酚含量与自由基清除率呈现较为明显的上升，且料液比在1∶25（g/mL）附近时，可取得较高的总酚含量与DPPH自由基清除率。

图2 不同料液比下总酚含量与自由基清除率

在1∶25～1∶30（g/mL），虽然多酚得率与自由基清除率仍在上升，但此过程中增长幅度较为缓慢，可能因多酚已经充分溶解所致。综合实际生产中成本与节能因素，选择料液比1∶25（g/mL）作为标准，1∶20，1∶25和1∶30（g/mL）为较合适的料液比试验水平。

2.2.3 时间确定

时间是影响石榴皮多酚提取效果的重要因素之一。从图3中得出，两条曲线均随时间的增长先增加后降低。提取时间从5 min增长至20 min时，多酚从原料中不断溶出，提取效果较为充分。在此之后，可能由于多酚稳定性较低，在浸提过程中降解，得率与抗氧化能力稍有下降。综上所述，选择20 min作为标准，15，20和25 min为较合适的时间试验水平。

图3 不同时间下总酚含量与自由基清除率

2.2.4 温度确定

在不同温度下，石榴皮多酚的得率和自由基清除率同样呈现出先增后减的趋势。如图4所示，在60 ℃左右，为相对适宜的提取温度。温度升高有利于分子运动，溶解速率加快，有助于活性物质的溶出。当温度继续升高之后，由于多酚在高温下不稳定，易降解，因此得率与抗氧化活性稍有下降。综上所述，60 ℃作为标准，50，60和70 ℃为较合适的温度试验水平。

图4 不同温度下总酚含量与自由基清除率

2.3 总酚含量与总抗氧化力间的相关性

在单因素试验结果的基础上，分别计算在不同乙醇体积分数、料液比、时间与温度下石榴皮多酚的得率与自由基清除率之间的线性相关系数（R2），结果如表3所示。

表3 总酚含量与抗氧化能力的相关性

由表3可以看出，在多种不同条件提取的石榴皮多酚中，其总酚含量与抗氧化活性都存在较强的正相关性，验证了石榴皮多酚的抗氧化特性，并且在一定范围内随浓度升高而增强。

2.4 提取条件优化

根据单因素试验结果，利用正交试验设计四因素三水平试验（表4），对所得提取液测定DPPH自由基清除率。通过极差分析法可知，各因素对抗氧化活性的影响顺序为乙醇体积分数＞料液比＞时间＞温度，并且得出了可能更佳的提取工艺，即A3B3C1D2，乙醇体积分数50%，料液比1∶30（g/mL），时间15 min，温度60 ℃。随后进行验证试验，在其他因素水平一致的情况下进行提取，重复测定DPPH自由基清除率35.62%，高于正交试验中试验6的抗氧化能力，是获取高抗氧化性石榴皮多酚较好的提取方法。

表4 正交试验设计与结果

通过方差分析（表5）表明：整体试验的差异显著，模型P＜0.001，初步说明试验结果有较强显著性；各因素A、B、C、D的显著性均满足P＜0.05，说明试验设计较为合理，各因素对石榴皮多酚的自由基清除率均有显著影响，且影响顺序为乙醇体积分数＞料液比＞时间＞温度，与上文分析得出的结论一致。

表5 正交试验方差分析表

2.5 石榴皮多酚的HPLC法鉴定

2.5.1 石榴皮多酚中四种主要成分的含量

试验采取外标法，保留时间定性，峰面积定量，作出四种待测标准物质的标准曲线，且R2＞0.99，说明在该检测范围内，质量浓度与峰面积的线性关系良好。

2.5.2 石榴皮多酚的高效液相色谱检测

四种标准品的保留时间与出峰顺序如图5（a）所示。在此条件下进行液相色谱，4种待测成分均得到了较好的分离。其中安石榴苷存在α、β两种同分异构体，因此在液相色谱中存在保留时间不同的两个色谱峰。在此基础上对三种抗氧化活性不同的样品（分别编码为高、中、低抗氧化性）进样并通过高效液相色谱检测，结果如图5（b）所示。四种成分的分离度较好，保留时间较稳定，且各成分的保留时间与标准品的保留时间一致，因此可采用上述线性回归方程对样品中四种酚类物质的含量进行定量分析（表6）。

图5 样品液相色谱

表6 石榴皮多酚样品中4种酚类物质测定单位：μg/mL

在测定的抗氧化活性不同的三种样品中，含量顺序为安石榴苷＞鞣花酸＞没食子酸＞儿茶素。通过计算可得出，石榴皮多酚的抗氧化活性与其中主要活性成分的含量有一定的相似性，特别是作为含量最高且抗氧化能力最强的安石榴苷，通过试验可验证这一结论，即其含量或将显著影响石榴皮多酚样品的抗氧化活性。

3 讨论与结论

以石榴皮多酚为研究对象，分析其提取过程、抗氧化能力与组成分析。采用的复合酶解—超声—溶剂浸提法，较之传统的溶剂浸提法而言，更加高效，且对于石榴皮多酚中主要成分安石榴苷也有较好的提取效果，具有良好的发展前景。

通过单因素试验与正交试验，考察不同水平对提取石榴皮多酚的影响，得出0.20 mg/mL的复合酶浓度（W纤维素酶∶W果胶酶=1∶2）、乙醇体积分数50%、料液比1∶30（g/mL）、时间15 min、温度60 ℃为较适宜的提取条件，显著优于其他条件下所提取的抗氧化活性（P＜0.01）。此时总酚含量达200.32 mg GAE/g DW，DPPH自由基清除率为35.62%。并且，石榴皮多酚的总酚含量与抗氧化能力在一定范围内呈线性正相关关系。

进一步探索石榴皮多酚中具抗氧化活性的多酚成分，通过HPLC高效液相色谱法进行分析可以发现，石榴皮多酚的含量与抗氧化性呈现正相关性。不同样品中均存在安石榴苷＞鞣花酸＞没食子酸＞儿茶素含量趋势，因此可推测质量组成及抗氧化活性的主要成分为安石榴苷。