宁唤唤 任瑞 康健 白鹭 路延之 谢燕玲 张芳琳 柏银兰

1.空军军医大学基础医学院微生物与病原生物学教研室，陕西西安 710032；2.延安大学生命科学学院，陕西延安 716000

结核病（tuberculosis，TB）是一种严重的传染病，其病原体是结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）[1]。结核菌素皮肤试验是临床诊断Mtb 感染的主要方法[2]，该方法采用结核菌素纯蛋白衍生物为刺激抗原，其不能区分卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）接种、非结核分枝杆菌和Mtb 感染[3]。因此，开发快速、特异且敏感的诊断方法对于控制TB 流行十分重要。

BCG 是牛分枝杆菌经传代获得的减毒株，在传代中缺失了16 个基因差异区（region of difference，RD）[4]。RD1 区是BCG 减毒过程中最早丢失的。6 kD 早期分泌靶抗原（6 kD early secretory antigenic target，ESAT-6）由Rv3875（esxA）基因编码，该基因位于Mtb RD1 区，在BCG 及绝大多数非结核分枝杆菌中不存在[5]。培养滤液蛋白10（culture filtrate protein，CFP-10）是由RD1区Rv3874 基因编码的分泌抗原，通常与ESAT-6 形成异源二聚体[6]。γ-干扰素释放试验（interferon-gamma release assay，IGRA）是体外诊断TB 的免疫学方法，该方法是基于Mtb 感染致敏的ESAT-6 和CFP-10 特异性T 细胞，IGRA 诊断活动性TB 的敏感性和特异性高于结核菌素皮肤试验[7]。目前市售的ESAT-6 单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）由Abcam 公司生产（11G4，ab26246）。本研究以重组ESAT-6 蛋白免疫小鼠，制备抗ESAT-6 的mAb，为诊断Mtb 感染、研发抗感染疫苗及药物奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与实验动物

大肠埃希菌（Escherichia coli，E.coli）BL21、DH5α、小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0、E.coli BL21 pET-28a（+）-ESAT-6[8]为课题组保存。Mtb H37Rv、Mtb H37Ra、BCG、耻垢分枝杆菌、肺炎链球菌和E.coli 菌体蛋白为前期制备。8 只6～8 周龄SPF 级雌性BALB/c 小鼠由空军军医大学实验动物中心提供，使用许可证号：SYXK（陕）2019-001，生产许可证号：SCXK（陕）2019-001。小鼠饲养温度为（20±1）℃，湿度为50%，饮用无菌水并喂养普通饲料。本研究经空军军医大学第二附属医院伦理委员会批准（TDLL-2016325）。……