刘昱昭，孙莹姗，王颜刚，李文怡

1 青岛大学附属医院内分泌科，山东 青岛 266003；2 山东中医药大学第一临床医学院

糖尿病患者发生动脉粥样硬化性疾病的可能性比非糖尿病患者高2～4倍，且具有发病早、进展快的特点，70%～80%糖尿病患者死于大血管病变。血糖较高或波动较大的糖尿病患者发生血管并发症的风险显著高于血糖稳定患者［1］。研究表明，血糖、LDL-C 及同型半胱氨酸（Hcy）都具有致动脉粥样硬化的作用。血清Hcy能经多种机制导致血管疾病发生，是糖尿病及其血管并发症发生发展的独立危险因素［2］。目前双胍类药是一线降糖药物，二甲双胍可有效降低2 型糖尿病患者的血糖和心血管病死率。有研究发现，长时间应用二甲双胍降糖的患者会出现叶酸、维生素B12代谢异常，进而导致高同型半胱氨酸血症（HHcy）的发生；但也有研究发现，二甲双胍不仅不会升高糖尿病患者Hcy，反而能使血清Hcy 水平下降［3-4］。Hcy 可反映维生素B12的状态，二甲双胍对Hcy 有影响［5］。研究显示，冠心病患者的血清Hcy 水平与肠道菌群有关，尤其是与双歧杆菌、大肠杆菌显著相关；脑卒中患者肠道菌群紊乱也会导致叶酸、维生素B12代谢异常，从而引起血清Hcy 水平发生变化；且移植卒中患者肠道菌群的大鼠，较移植健康人群肠道菌群的大鼠，维生素B12、叶酸水平低，Hcy 水平高［6-8］。二甲双胍通过改变糖尿病患者肠道菌群组成及其代谢产物进而影响糖脂代谢［9-10］，但二甲双胍对糖尿病患者Hcy 代谢的影响是否与肠道菌群的改变存在相关性仍鲜见报道。2020年11 月—2022 年7 月，本研究探讨了二甲双胍对糖尿病大鼠血清Hcy 水平及其肠道菌群的影响，以期为糖尿病及其并发症防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 20 只SPF 级健康雄性SD大鼠，4 周龄，体质量（100 ± 20）g，购于北京斯贝福生物技术有限公司［动物许可证：SCXK（京）2019-0010］，质检免疫后适应性饲养1 周。动物房温度（25 ± 1）℃，湿度30%～40%，12 h 明/暗周期，通风良好，动物自由饮水和摄食。大鼠维持饲料、高糖高脂饲料购于江苏省协同医药生物工程有限公司，盐酸二甲双胍片购自中美上海施贵宝制药有限公司，链脲佐菌素（STZ）购于美国Sigma 公司，大鼠Hcy ELISA 检测试剂盒购自武汉纯度生物科技有限公司。全密闭组织脱水机、石蜡包埋机、石蜡切片机、自动封片机（德国Leica 公司），台式离心机（上海安亭科学仪器厂），-80 ℃超低温冰箱（日本三洋电机株式会社），电子分析天平（上海博通经贸有限公司），血糖仪（拜耳医药保健有限公司）。

1.2 动物分组、模型构建及干预 适应性饲养1 周后，随机选取5只大鼠作为正常对照组，给予普通饲料喂养；余15 只均构建糖尿病模型，给予高糖高脂饲料喂养4周，禁食不禁水12 h后，一次性腹腔注射1% STZ 溶液35 mg/kg。10 d 后采尾尖静脉血，用血糖仪测定随机血糖，以连续2 次血糖≥16.7 mmol/L为造模成功。将糖尿病大鼠模型随机分为二甲双胍组7只、模型组8只。二甲双胍组予二甲双胍悬浊液200 mg/（kg·d）灌胃，模型组每天予等量双蒸水灌胃，连续灌胃8 周。实验结束时，二甲双胍组、模型组分别脱落2、1只。

1.3 标本采集 干预8周后，禁食不禁水12 h，用10%水合氯醛溶液麻醉大鼠并固定，常规消毒，取心尖血约8 mL，室温下于促凝管中静置20 min，3 000 r/min离心15 min，离心半径16 cm，取血清冻存于-80 ℃冰箱。灌注后取大鼠结肠约5 cm，置于4%多聚甲醛固定液中以备HE 染色观察肠道病理组织改变。从结肠根部取约1 g 粪便，冻存于-80℃冰箱，为16S高通量测序备用。

1.4 一般情况观察 观察大鼠的进食、饮水、大小便、毛色、活动情况。

1.5 血糖检测 于干预第1、4、8 周末称重，取尾尖血检测血糖。

1.6 血清Hcy 及血脂检测 用ELISA 法检测血清Hcy，用全自动生化分析仪检测血清TG、TC、HDL-C、LDL-C。

1.7 结肠组织病理变化观察 采用HE 染色法。结肠组织固定后，制作石蜡切片，进行HE 染色，采用病理切片扫描机扫描观察。

1.8 肠道菌群分析 用MagPure Stool DNA KF Kit试剂盒提取粪便样本DNA，进行16SDNA 测序及分析。PCR 扩增，建立文库，用Agilent 2100 生物分析仪检测文库的片段浓度及范围，应用HiSeq 平台行高通量测序。对原始测序数据进行过滤，使用FLASH 软件v1.2.11 进行序列拼接，得到高变区的Tags，在97%序列相似度下，用USEARCH 将Tags 进行聚类，生成分类操作单元（OTU）代表序列，采用序列之间的97%相似性把某一个分类单元定义为一个OTU，每个OTU 对应于一种代表序列。利用UCHIME将扩增后产生的嵌合体从OTU代表序列中去除，并在Gold database 数据库中进行比较检测，使用Usearch global 法将所有Tags 比对回OTU 代表序列，得到每个样品的OTU 丰度统计表。通过RDP classifer v2.2 软件将序列和已知物种数据库比对，进行物种注释，并对测序结果进行生物学信息分析。对测序数据结果进行OTU 分析及Alpha 多样性分析。OTU 分析结果用Venn 图和物种组成柱状图来表示，反映样本间物种门水平、目水平和属水平的物种变化。Alpha 多样性用稀释曲线与盒形图来表示，稀释曲线评价测序量能否覆盖所有微生物物种及样品中物种丰富程度，Chao 指数评价物种丰度，Shannon评价多样性。

1.9 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK 法。不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，多组比较采用Kruskal-Wallis 检验，进一步两两比较采用Bonferroni法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组一般情况比较 正常对照组状态良好，体质量逐渐增加，摄食饮水、大小便正常，毛色光亮，活动敏捷。模型组饮水进食量增多，尿量明显增加，精神萎靡，反应迟缓，毛色暗淡，体质量略下降。二甲双胍组糖尿病典型症状缓解，皮毛暗淡、精神萎靡等表现与模型组比较有一定改善。

2.2 三组各时点血糖比较 见表1。

表1 三组血糖变化（mmol/L，±s）

表1 三组血糖变化（mmol/L，±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别正常对照组模型组二甲双胍组n 5 7 5血糖干预第1周5.32 ± 0.24 27.35 ± 5.08*25.36 ± 5.08干预第4周5.22 ± 0.19 26.91 ± 4.56*20.08 ± 4.17#干预第8周5.18 ± 0.14 25.97 ± 4.83*19.70 ± 4.62#

2.3 三组血清Hcy及血脂水平比较 见表2。

表2 三组血清Hcy及血脂水平比较（±s）

表2 三组血清Hcy及血脂水平比较（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别正常对照组模型组二甲双胍组n 5 7 5 Hcy（μmol/L）14.0 ± 1.6 16.4 ± 1.9*14.6 ± 2.0#TG（mmol/L）0.64 ± 0.21 0.86 ± 0.47 1.18 ± 0.85 TC（mmol/L）2.05 ± 0.53 2.13 ± 0.21 2.32 ± 0.33 HDL-C（mmol/L）0.56 ± 0.13 0.65 ± 0.17 0.63 ± 0.19 LDL-C（mmol/L）0.26 ± 0.05 0.58 ± 0.09*0.56 ± 0.21*

2.4 三组结肠组织病理变化比较 正常对照组结肠组织未见明显病理变化；模型组结肠固有层可见较多炎细胞浸润，肠道结构损伤程度较重，细胞形态不完整；二甲双胍组炎细胞浸润较轻，细胞形状与正常对照组差别小。

2.5 三组肠道菌群检测结果比较

2.5.1 OTU分析结果 正常对照组、模型组、二甲双胍组OTU值分别为412.53 ± 51.69、381.57 ± 53.12、438.60 ± 28.58。与正常对照组比较，模型组OTU值低（P＜0.05）；与模型组比较，二甲双胍组OTU值高（P＜0.05）。三组共有的OTU 423 个，正常对照组、模型组、二甲双胍特有的OTU分别为180、32、60个。三组肠道菌群门、目、属水平构成比较见表3～5。

表3 三组肠道菌群门水平构成比较［%，M（P25，P75）］

2.5.2 Alpha 多样性分析结果 模型组的物种丰富度低于正常对照组，二甲双胍组的物种丰富度与正常对照组相近。见图1。

图1 Alpha多样性分析

3 讨论

近年来文献报道二甲双胍治疗过程中存在Hcy代谢异常，虽然结果不一致，但由于Hcy是心血管疾病、糖尿病大血管病变的独立危险因素，因此二甲双胍对糖尿病Hcy代谢及其机制研究越来越受到关注。本研究模型组大鼠血糖一直维持在较高水平，8周后出现了血清Hcy明显升高，与正常对照组大鼠比较有显著统计学差异，提示糖尿病大鼠有明显的Hcy代谢紊乱。二甲双胍组大鼠经二甲双胍干预后，血糖显著下降，血清Hcy水平也明显降低并接近正常对照组水平。说明二甲双胍能有效降低血糖和血清Hcy水平。已有研究证实，糖尿病患者血清Hcy水平明显高于健康人。林园等［4，11］应用二甲双胍治疗2 型糖尿病，周期3个月，患者的血糖和糖化血红蛋白均显著下降，胰岛素抵抗指数下降，而且结果显示血清Hcy水平明显下降，这与我们的研究结果一致。但是朱锋等［3，12］研究却发现二甲双胍治疗糖尿病半年以上，虽然明显降低空腹血糖、餐后2 h血糖和糖化血红蛋白，但是血清维生素B12和叶酸水平明显降低，血清Hcy 水平显著升高，而且Hcy 的升高与血清维生素B12、叶酸的降低及二甲双胍使用剂量有关，这与本研究结论相反。原因可能是因为短期和长期服用二甲双胍对糖尿病血清Hcy代谢的作用机制不同。

表4 三组肠道菌群目水平构成比较［%，M（P25，P75）］

表5 三组肠道菌群属水平构成比较［%，M（P25，P75）］

既往研究表明，二甲双胍除具有降糖、影响Hcy和脂质代谢，调节肠道菌群，改善炎症反应的作用［13-14］。袁凤易等［9］采用二甲双胍治疗新诊断的2型糖尿病患者3 个月，患者变形菌门和拟杆菌门的多个物种相对丰度有所上调，厚壁菌门相对丰度下调。葛方升等［10］采用二甲双胍治疗60例老年2型糖尿病患者3 个月，发现观察组患者肠道菌群较治疗前和正常对照组均有改变，主要表现为有益菌（双歧杆菌、乳杆菌、拟杆菌等）显著增加，某些中性菌（肠球菌、肠杆菌等）减少，炎症因子水平显著降低。近年研究还发现，血清Hcy 代谢与肠道菌群存在相关性。妙炜等［8］发现，与移植健康人群肠道菌群组比较，移植卒中患者肠道菌群的维生素B12、叶酸水平降低，Hcy 水平升高。石翠等［6］发现，冠心病患者存在HHcy，患者血清Hcy 水平与大肠杆菌、双歧杆菌和乳酸杆菌的数量分别呈显著正相关、显著负相关和无相关性。张国勇等［7］发现，PCI手术的冠心病患者血清Hcy 明显升高，肠道菌群紊乱，乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌数量与血清Hcy 呈显著负相关。本研究发现，模型组结肠可见病理变化，大量炎细胞浸润，肠道结构损伤，肠道细胞萎缩；而且模型组肠道菌群也出现显著改变，OTU 值降低，其中拟杆菌门相对丰度明显增加，厚壁菌门相对丰度显著降低；拟杆菌目相对丰度明显增高，梭菌目相对丰度明显降低；普氏菌属相对丰度明显升高，颤落菌属、瘤胃球菌属相对丰度下降。提示糖尿病大鼠存在肠道菌群紊乱。二甲双胍干预后，大鼠肠道结构受损较轻，细胞形态接近正常，炎细胞浸润程度较轻；肠道菌群OTU 值升高，肠道菌群紊乱有所改善。与模型组比较，二甲双胍组拟杆菌门相对丰度显著降低，厚壁菌门则显著增加，菌群结构与正常对照组相近；梭菌目相对丰度升高，拟杆菌相对丰度下降；普氏菌属显著降低，考拉杆菌属相对丰度显著增加。Alpha 多样性分析显示，模型组显著降低；而二甲双胍干预则显著增加Alpha 多样性，并与正常对照组水平相近。因此，短期服用二甲双胍治疗糖尿病引起的肠道菌群变化可能是血清Hcy 降低的重要机制之一，而长期服用二甲双胍治疗引起的Hcy升高可能是肠道菌群发生新的失衡而导致叶酸、维生素B12生成减少。

综上所述，二甲双胍能有效降低糖尿病大鼠血糖及血清Hcy水平，调节肠道菌群，进而可能对糖尿病并发症起到一定防治作用。但本研究因条件有限，未能进一步验证，如长时间应用二甲双胍是否会导致肠道菌群改变，以致出现血清维生素B12和叶酸水平降低，血清Hcy水平升高；且未能进一步探索具体细菌种属改变。后期研究将进一步挖掘肠道菌群改变的作用机制。