郭继芳，韩宇博，金 娟，刘 莉

内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是细胞对外界刺激的一种应激响应，强烈或持续的刺激激活凋亡信号通路，引起细胞凋亡[1-2]。抑制ERS可保护心肌，是防治心血管疾病的靶点之一[3]。本研究应用异丙肾上腺素(isoproterenol，ISO)诱导SD大鼠心肌损伤，给予参芪益心方治疗，检测肌醇需求酶1(inositol-requiring Enzyme 1，IRE1)、裂解凋亡蛋白酶-3(Cleaved Cysteine-containing aspartate-specific protease-3，Cleaved Caspase-3)的变化情况，探讨参芪益心方对心肌损伤的保护机制与抑制ERS的关联性。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体(specific pathogen free animal，SPF)级SD雄性大鼠40只，6～8周龄，购于哈尔滨医科大学实验动物学部，许可证号：SCXK(黑)2019-001，批次No.230729211100021921，体质量(200±20)g。动物饲养于牡丹江医学院医药研究中心四楼动物饲养室，室温22 ℃，湿度60%。动物实验设施使用许可号：SYXK(黑)2019-003。本实验通过牡丹江医学院实验动物福利与伦理委员会批准，批准文号：20210901-10。

1.2 主要药物及试剂 参芪益心方(人参20 g，黄芪20 g，仙鹤草30 g，白术15 g，茯苓20 g，淫羊藿20 g，桂枝10 g，葶苈子15 g，丹参15 g，益母草15 g，甘草10 g，安徽药知源中药饮片有限公司，浓煎至含生药5 g/mL)，盐酸异丙肾上腺素(规格：每瓶5 g，批号：S31064，上海源叶生物科技有限公司)，盐酸曲美他嗪片[规格：每片20 mg，批号：2019110，批准文号：国药准字：H20055465，施维雅(天津)制药有限公司]；苏木素(北京索莱宝生物科技有限公司)，伊红(安徽雷根生物技术有限公司)，蛋白裂解液(RIPA裂解液)，PMSF(蛋白酶抑制剂)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE凝胶配制Kit，QuickBlockTMWesternTM溶液套装，电化学发光(ECL)法显色底物试剂盒(碧云天生物技术有限公司)，Page Ruler Prestain Protein Ladder彩色预染蛋白质分子量标准(Thermo Scientific公司)，β-Actin Rabbit Monoclonal Antibody、IRE1 Antibody、Cleaved-Caspase 3 Antibody(Affinity Biosciences公司)，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(碧云天生物技术有限公司)。

1.3 主要仪器 脱水机、切片机、包埋机(德国莱卡公司)；RM6240多通道生理记录仪(成都仪器厂)；电泳仪、转膜仪(BIO-RAD公司)；佳能东芝Aplio i700超声仪(日本佳能)；恒温水浴锅(上海蓝伊科学仪器厂)；低温高速离心机(Eppeadorf 公司)；酶标仪(Molecular Devices公司)；超微量核酸蛋白测定仪(型号：NanoDrop one，Thermo Fisher Scientific 公司)；化学发光成像系统(GE公司)。

1.4 模型建立 SD大鼠适应性饲养1周，随机选取8只作为对照组，其余32只作为实验组，实验组给予颈背部皮下注射异丙肾上腺素建模，诱导心肌损伤，剂量为每日2 mg/kg，对照组皮下注射等量的生理盐水，实验连续2周。

1.5 分组与给药 实验2周后对对照组和实验组(随机选取8只)大鼠进行心电图检查，超声心动图确定造模成功。将32只实验组大鼠随机分为异丙肾上腺素组、曲美他嗪组、参芪益心方低剂量组和参芪益心方高剂量组，每组8只，早上继续皮下注射异丙肾上腺素，对照组给予等量生理盐水；每晚各组分别灌胃1次，曲美他嗪组给予曲美他嗪混悬液每日5 mg/kg，参芪益心方低剂量组给予参芪益心方水煎剂每日10 g/kg，参芪益心方高剂量组给予参芪益心方水煎剂每日20 g/kg，对照组和异丙肾上腺素组给予等量生理盐水灌胃，实验连续2周。

1.6 心电图检查 SD大鼠分别于实验给药2周末、4周末，应用RM 6240系列多道生理信号采集处理系统usb 3.0a(I)描记心电图。首先，大鼠吸入异氟烷麻醉后，按照右上肢绿色、右下肢黑色、左下肢红色连接导联线，导联线的最前方为齿状镊子，镊子内放置针灸针，将针灸针钳紧并固定，操作时将针灸针刺入相应肢体皮下，注意不要插入肌肉组织，记录心电图(速率：40 ms/div，电压：250 μV)。

1.7 超声心动图检测 SD大鼠分别于实验2周末、4周末行超声心动图检查。大鼠吸入麻醉后，取仰卧位，心前区至剑突备皮，采用佳能东芝Aplio i700超声仪，选用探头频率14 MHz，与胸骨成20°～30°的夹角，显示沿二尖瓣瓣口至心尖方向的心脏左室长轴切面，超声测定左室前壁舒张末厚度(Dist A)、舒张末心室内径(Dist B)、左室后壁舒张末厚度(Dist C)、收缩期心室内径(Dist D)，应用Teichholtz公式计算左室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS)。

1.8 心肌组织病理学检查 实验4周末采用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，用剪刀剪开大鼠胸腔取出心脏，心脏组织于4 %多聚甲醛中固定48 h，制备病理切片，苏木精-伊红(HE)染色，光学显微镜观察。

1.9 蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测心肌组织IRE1、Cleaved Caspase-3蛋白表达水平 取心尖部20 mg组织，提取总蛋白；超微量核酸蛋白测定仪测浓度；SDS-PAGE凝胶电泳；转膜；QuickBlockTMWestern溶液套装封闭振荡1 h；一抗(1∶1 000稀释)，4 ℃冰箱摇床孵育过夜；洗膜3次；二抗(1∶1 000稀释)，室温震荡孵育1 h；洗膜3次；ECL发光试剂显影，曝光，软件Image J对目的蛋白条带行灰度值半定量分析，结果用目的蛋白/β-Actin比值表示。

2 结 果

2.1 各组大鼠心电图变化比较 实验2周末，实验组心电图可见q波，ST段轻度抬高，实验组较对照组心率增快，差异有统计学意义(P<0.05)。详见图1、表1。实验4周末，异丙肾上腺素组q波振幅加深、ST段抬高，且心率较对照组明显增快，差异有统计学意义(P<0.05)；曲美他嗪组q波振幅减小，参芪益心方低剂量组ST段抬高幅度减小；参芪益心方高剂量组ST段位于等电位线上，无明显偏移，参芪益心方低剂量组、参芪益心方高剂量组相比异丙肾上腺素组，心率明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。详见图2、表2。

表1 实验2周末对照组与实验组大鼠心率变化比较(±s) 单位：次/min

图2 实验4周末大鼠心电图

表2 各组大鼠实验4周末心率变化(±s) 单位：次/min

2.2 各组大鼠超声心动图检测比较 实验2周末，与对照组比较，实验组大鼠Dist A、Dist C增加，Dist B、Dist D降低，LVEF、LVFS减低，差异均有统计学意义(P<0.05)，造模成功。详见图3、表3。实验4周末，异丙肾上腺素组与对照组比较，大鼠Dist A、Dist C减小，Dist B、Dist D增加，LVEF、LVFS明显减低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与异丙肾上腺素组比较，曲美他嗪组、参芪益心方低剂量组、参芪益心方高剂量组在药物干预后各项指标均有改善，差异均有统计学意义(P<0.05)，且参芪益心方高剂量组优于参芪益心方低剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图4、表4。

图3 实验2周末对照组与实验组大鼠超声心动图

表3 实验2周末对照组与实验组大鼠超声心动图指标变化(±s)

图4 实验4周末各组大鼠超声心动图

表4 实验4周末各组大鼠超声心动图指标变化(±s)

2.3 各组大鼠HE染色结果比较 对照组大鼠心肌细胞结构清晰，染色均匀，心肌纤维呈束状规则排列。而异丙肾上腺素组心肌细胞肥大、结构紊乱，胞核不规则，可见核聚集；细胞间质血管充血扩张，炎细胞浸润，成纤维细胞明显增生；心肌纤维疏松肿胀，排列紊乱，可见肌纤维断裂与空泡样变性坏死。与异丙肾上腺素组比较，曲美他嗪组心肌间质少量炎细胞浸润，心肌纤维轻度肿胀；参芪益心方低剂量组和参芪益心方高剂量组纤维排列相对规则，断裂与空泡变性减少，并且参芪益心方高剂量组优于参芪益心方低剂量组。详见图5。

图5 各组大鼠心肌组织HE染色(光学显微镜，×200)

2.4 各组大鼠Western Blot检测结果比较 异丙肾上腺素组大鼠心肌组织IRE1、Cleaved Caspase-3蛋白表达水平较对照组明显升高，差异均有统计学意义(P<0.001)；与异丙肾上腺素组比较，曲美他嗪组、参芪益心方低剂量组和参芪益心方高剂量组IRE1、Cleaved Caspase-3蛋白水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与参芪益心方低剂量组比较，参芪益心方高剂量组IRE1、Cleaved Caspase-3蛋白表达水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图6、图7。

图6 各组大鼠IRE1、Cleaved Caspase-3蛋白表达条带图

异丙肾上腺素组与对照组比较，＊ P<0.001；与异丙肾上腺素组比较，# P<0.05；与参芪益心方低剂量组比较，△ P<0.05。

3 讨 论

ERS是细胞在受到应激刺激后所引起的内质网稳态被破坏，引起未折叠或错误折叠蛋白质不能被有效清除，导致这些蛋白质在内质网腔异常蓄积。机体为了对抗应激带来的不利损伤，内质网启动未折叠蛋白反应(unfolded protein reaction，UPR)维持细胞存活[4]。ERS发生后，内质网上调分子伴侣表达水平，抑制蛋白质再合成，促进错误折叠蛋白质及未折叠蛋白质的降解缓解ERS[5]。强烈或持久地刺激激活凋亡相关因子和信号通路，引起细胞凋亡。IRE1是ERS的重要调节因子，在UPR和细胞凋亡中发挥关键作用[6]。IREI是存在于内质网膜上的感受内质网内应激信号的一类跨膜感受蛋白，兼具激酶活性和核酸内切酶活性。当内质网受到应激刺激时，IRE1发生二聚化和自身磷酸化，激活IRE1上的核糖核酸酶域[7]，通过内质网相关性降解(ER assocated degradation，ERAD)减少未折叠或错误折叠蛋白在内质网内的蓄积[8]凋亡蛋白酶(Caspases)是促细胞凋亡的一种蛋白酶[9-10]，处于细胞凋亡的核心地位[11]。Caspase-3通过级联反应诱发凋亡[12]，可水解DNA酶抑制物、细胞质及细胞核骨架成分，引起DNA降解、胞核固缩、核膜分解，产生凋亡小体细胞凋亡[13]。Caspase-3是最关键的细胞凋亡执行者，而Cleaved Caspase-3是其活化形式，Cleaved Caspase-3可更有效地评估细胞凋亡程度。安琪等[14]研究发现，丹参可明显降低葡萄糖调节蛋白94(GRP94)、IRE1、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)、凋亡蛋白酶-12(Caspase-12)、Cleaved Caspase-3水平，ERS参与并改善异丙肾上腺素诱导的心肌损伤。本研究中异丙肾上腺素组IRE1、Cleaved Caspase-3蛋白表达水平明显增加，表明ERS参与了心肌损伤，并启动凋亡信号通路。

参芪益心方是导师刘莉教授总结多年临床经验，根据心力衰竭的本虚标实病机，以益气温阳、活血利水为基本治法，制定治疗心力衰竭的协定处方。本课题组前期的研究发现参芪益心方可影响心肌能量代谢[15-17]、改善心功能[18-19]和减少炎性细胞因子的产生[20]，本实验研究证实参芪益心方对异丙肾上腺素诱导的心肌损伤具有保护作用。

综上所述，ERS参与了异丙肾上腺素诱导心肌损伤，参芪益心方发挥心肌保护作用，其机制与抑制内质网信号分子IRE1、Cleaved Caspase-3表达有关，且高剂量组效果更明显。