龙宪伟 刘 洪 菅志远

(桂林医学院附属医院1 胃肠外科，2 肝胆外科，广西桂林市 541001)

胰腺导管腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤，近年来其发病率和病死率均呈逐年上升的趋势[1-2]。胰腺导管腺癌的发生和发展是一个多因素、多基因共同参与的过程[3]，目前其分子机制尚未完全清楚。近年来，随着生物信息技术的快速发展，有研究表明多种基因的差异表达与胰腺导管腺癌密切相关[4]。程序性细胞死亡分子(programmed cell death,PDCD)10位于3号染色体(3q26.1)上，由212个氨基酸组成[5]。研究表明，PDCD10基因的差异表达与多种疾病的病理生理过程密切相关，包括肝癌[6]、胶质母细胞瘤[7]、卵巢癌[8]、脑血管疾病[9-10]、肺癌[11]、胃癌[12]等。但目前关于PDCD10基因在胰腺导管腺癌中的作用机制尚未完全明确。本文通过生物信息学方法分析PDCD10基因在胰腺导管腺癌患者中的表达水平及其与患者预后的相关性，旨在为胰腺导管腺癌的诊治提供新思路。

1 资料与方法

1.1 GEPIA数据库分析 GEPIA数据库(http://gepia2.cancer-pku.cn)是基于TCGA数据库和GTEx数据库的信息，用于差异表达分析、轮廓图绘制、患者生存分析、相似基因检测的在线工具，本研究利用其分析PDCD10基因在胰腺导管腺癌组织和正常胰腺组织中表达水平的差异，以及与胰腺导管腺癌患者预后的关系。

1.1.1 PDCD10基因在胰腺导管腺癌组织和正常胰腺组织中的表达差异分析：选择“Expression Analysis”中的“Expression DIY”，再选择“Box Plot”，然后在“Gene”中输入PDCD10，在“|log2FC|Cutoff”中输入2，在“p-value Cutoff”中输入0.001，设定“Cancer name”为“PAAD”，选择“Match TCGA normal and GTEx data”，其他为默认选项。

1.1.2 PDCD10基因表达水平与胰腺导管腺癌患者预后之间的关系分析：选择“Expression Analysis”中的“Survival Analysis”。分析总体生存率时，在“Gene”中输入PDCD10，设定“Methods”为“Overall Survival”在“Cutoff-High(%)”和“Cutoff-Low(%)”中均输入50，设定“Cancer name”为“PAAD”，设定“Axis Units”为“Months”，其他为默认选项。分析无病生存率时，设定 “Methods”为“Disease Free Survival(RFS)”，其他参数同上。

1.2 UALCAN数据库分析 UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/)是主要基于TCGA数据库中的相关癌症数据进行分析的在线工具，本研究利用其分析PDCD10基因在胰腺导管腺癌组织中的甲基化水平。设定“Enter gene symbol(s)”为PDCD10，选择“TCGA”为“dataset Pancreatic Adenocarcinoma”，再选择“Methylation”。

1.3 LinkedOmics 数据库分析 LinkedOmics数据库(http://www.linkedomics.org)是一个多组学数据库，本研究利用其分析PDCD10基因在胰腺导管腺癌组织中的共表达基因，并对共表达基因进行基因本体论(Gene Ontology，GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析。

1.3.1 PDCD10基因在胰腺导管腺癌病灶组织中的共表达基因分析：在LinkFinder模块中，设定“Select cancer cohort”为“PAAD”，设定“Select search dataset:Data type”为“RNA seq”， 在“Select sample dataset”中输入No input， 在“Select search dataset attribute”中输入PDCD10，设定“Select target dataset:Data type”为“RNAseq”选择“Select statistical method”为“Pearson Correlation test”。

1.3.2 PDCD10基因的富集分析：选择“Select LinkInterpreter”，设定“Select tool”为“Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)”，选择“Enrichment Analysis”为“GO Analysis or KEGG”，然后点击“Select Submit Query”。

1.4 STRING网站分析 通过STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl)构建PDCD10基因的蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络图，设定“protein name”为PDCD10，“Organism”为Homo sapiens。

1.5 TIMER数据库分析 在TIMER数据库(http://timer.comp-genomics.org/)，设定“Gene Expression”为PDCD10，分析PDCD10基因表达水平与胰腺导管腺癌细胞纯度、各类型免疫细胞(CD8+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、B淋巴细胞、中性粒细胞、树突状细胞)浸润水平的相关性。

2 结 果

2.1 PDCD10基因在胰腺导管腺癌病灶组织和正常胰腺组织中的表达差异 GEPIA数据库的泛癌分析及PDCD10基因表达情况箱式图提示PDCD10在胰腺导管腺癌组织中呈高表达水平， PDCD10基因在胰腺导管腺癌组织中的表达水平高于正常胰腺组织(P<0.05)。见图1。

图1 PDCD10基因在胰腺导管腺癌病灶组织和正常胰腺组织中的表达差异

2.2 PDCD10基因表达水平与胰腺导管腺癌患者预后的关系 病灶组织中PDCD10基因低表达水平的胰腺导管腺癌患者的总体生存率及无病生存率均高于病灶组织中PDCD10基因高表达水平的患者(均P<0.05)。见图2。

图2 病灶组织中不同PDCD10基因表达水平的胰腺导管腺癌患者的生存曲线

2.3 PDCD10基因在胰腺导管腺癌组织中的甲基化水平 UALCAN数据库分析结果显示，PDCD10基因在胰腺导管腺癌组织中的甲基化水平升高(P<0.05)。见图3。

图3 PDCD10基因在胰腺导管腺癌组织中的甲基化水平

2.4 胰腺导管腺癌组织中PDCD10基因的共表达基因、功能及通路富集分析结果 在胰腺导管腺癌组织中，共有19 774个基因与PDCD10基因具有相关性，即共表达(见图4A)，与PDCD10基因呈正相关和负相关的前50个基因的热图见图4B、图4C。进一步对与PDCD10共表达的基因进行KEGG分析和GO富集分析。GO富集分析结果显示：与PDCD10基因共表达的基因的分子功能以细胞黏附分子结合、蛋白酶结合、细胞外基质结构成分、谷氨酸受体结合、神经递质结合、谷氨酸受体活性等为主；生物学过程以染色体分离、染色体定位、皮肤发育、ERBB信号通路、白细胞凋亡过程、GABA能神经肌肉过程、多细胞生物信号传导、突触传递、谷氨酸受体信号通路等为主；细胞组成以浓缩染色体、脱氧核糖核酸损伤部位、参与细胞黏附的蛋白质复合物等为主。KEGG通路分析结果显示：与PDCD10基因共表达的基因主要涉及免疫调节反应信号通路、ERBB信号通路、谷氨酸受体信号通路。见图5。

图4 在胰腺癌中与PDCD10基因具有相关性的基因火山图及正负相关基因热图

图5 与PDCD10基因共表达的基因的GO功能和KEGG通路富集分析

2.5 PDCD10基因的PPI网络 在PPI网络中，与PDCD10基因编码蛋白相互作用的主要蛋白有STRN4、SLMAP、STRIP1、STK24、SIKE1、STRN、FGFR1OP2、CCM2、MST4、STK25等(Degree值均>0.4)。见图6。

图6 PDCD10基因的PPI网络图

2.6 PDCD10基因表达水平与胰腺导管腺癌细胞纯度、各类型免疫细胞浸润水平的相关性 PDCD10基因表达水平与胰腺导管腺癌细胞纯度无相关性(r=-0.026，P=0.734)，与CD4+T淋巴细胞浸润水平呈负相关(r=-0.186，P=0.015)，与CD8+T淋巴细胞(r=0.362，P<0.001)、B淋巴细胞(r=0.334，P<0.001)、中性粒细胞(r=0.364，P<0.001)、巨噬细胞(r=0.232，P<0.001)、树突状细胞(r=0.392，P<0.001)浸润水平均呈正相关。见图7。

图7 PDCD10基因表达水平与胰腺导管腺癌细胞纯度、各类型免疫细胞浸润水平的相关性

3 讨 论

胰腺癌是一种具有高度侵袭性且致死率较高的消化道肿瘤，其中以胰腺导管腺癌最为常见。研究表明，胰腺癌患者的5年生存率不足8%，我国过去10年中胰腺癌导致的死亡病例在癌症相关死亡病例中占比增加了9%[13]。由于目前缺乏早期诊断胰腺癌的实验室指标，大多数患者就诊时肿瘤已处于晚期，治疗手段有限，且效果未达理想状态，患者的复发率及转移率较高[14-16]。因此，亟待进一步明确胰腺癌的发生、发展机制，以探寻更为有效的诊断和治疗手段。

PDCD基因家族成员高度保守，除了与细胞程序性死亡有关，还与发育障碍、免疫疾病、癌症等有关[17]。PDCD10基因最初被确定为凋亡相关基因[18]。研究表明，PDCD10广泛表达于各种类型细胞，如星形胶质细胞、神经元细胞、内皮细胞和肿瘤细胞等，在许多生理和病理生理过程中起着重要作用，包括细胞周期调节、肿瘤发生[19-20]、化疗耐药[21]和神经元细胞迁移[22-23]等。Zhang等[7]发现，在胶质细胞瘤中过表达PDCD10会招募和激活小胶质细胞/巨噬细胞，从而促进肿瘤进展。Fu等[24]发现，PDCD10与前列腺癌细胞增殖、迁移有关。由此可见，PDCD10与肿瘤的发生、发展密切相关。

本文运用生物信息学方法对胰腺导管腺癌的多个数据库数据进行分析。应用 GEPIA 数据库分析发现，PDCD10基因在胰腺导管腺癌组织中的表达水平高于正常胰腺组织，病灶组织中PDCD10基因低表达水平的胰腺导管腺癌患者的总体生存率及无病生存率高于病灶组织中PDCD10基因高表达水平的患者(均P<0.05)，这表明 PDCD10基因可能是胰腺导管腺癌诊断及预后评估的潜在分子标志物。为了解PDCD10基因在胰腺导管腺癌中的调控机制，本研究基于LinkedOmics数据库对与PDCD10基因共表达的基因进行GO功能和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析结果显示，与PDCD10基因共表达的基因主要参与染色体分离及定位、皮肤发育、多细胞生物信号转导、突触传递、GABA能神经肌肉过程等；KEGG通路富集分析结果显示，与PDCD10基因共表达的基因主要通过免疫调节反应信号通路、ERBB信号通路、谷氨酸受体信号通路参与胰腺癌的发生。因此推测PDCD10基因可能通过上述生物学过程及信号通路来介导胰腺导管腺癌的发生和发展。甲基化是表观遗传学的重要研究内容，基因的甲基化水平是评价恶性肿瘤发生、发展的重要标志物[25]。本研究结果显示，PDCD10基因在胰腺导管腺癌病灶组织中的甲基化水平升高(P<0.05)，这提示胰腺导管腺癌的发生和发展有可能受PDCD10基因甲基化水平的影响，但具体调控机制仍需进一步证实。

肿瘤的发生及转移与肿瘤细胞所处的内外环境密切相关，免疫微环境影响着肿瘤的发生和发展[26]。CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞具有显著的抗肿瘤作用[27]。本研究结果显示，PDCD10基因表达水平与CD4+T淋巴细胞浸润水平呈负相关，与CD8+T淋巴细胞、B淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞浸润水平均呈正相关(均P<0.05)，这或可为研究胰腺导管腺癌患者的免疫治疗提供新思路。此外，本研究的PPI网络结果显示，PDCD10基因编码的蛋白具有较多的相互作用蛋白，PDCD10基因编码的蛋白可能与这些蛋白相互作用参与胰腺导管腺癌的发生与发展。

综上所述，PDCD10基因在胰腺导管腺癌组织中呈高表达，其表达水平与胰腺导管腺癌患者的生存预后密切相关，胰腺导管腺癌的发生和发展可能与PDCD10基因甲基化水平有关。PDCD10基因或可成为胰腺导管腺癌诊断及预后评估的潜在分子标志物，这为胰腺导管腺癌的免疫治疗提供一定的理论基础。