邓旭霞，吕 翔，徐巍巍，刘雅飞

(河北中石油中心医院口腔科，河北 廊坊 065000)

正畸牙移动(orthodontic tooth movement，OTM)的重塑主要发生在牙周韧带区域附近[1]。已经发现压迫会使牙周韧带区域变窄并导致缺氧微环境，从而增强破骨细胞生成[2]。目前，在OTM期间，仍然存在许多正畸治疗挑战；例如，正畸力过度、不适当的力方向和治疗时间延长都可能导致医源性牙周组织损伤[3]。由于机械负荷在OTM期间牙周韧带和牙槽骨重塑中起着至关重要的作用，因此了解牙周组织在机械力下的生理反应并阐明潜在的分子机制可能具有重要的临床意义[4]。最近报道了Eph受体相互作用蛋白B2(Eph receptor interaction proteins B2，Ephrins B2)-肝细胞激酶B4(Erythropoietin-producing hepatocyte kinases B4，EphB4)信号在牙周组织中的表达，存在于各种细胞类型中，包括牙周膜成纤维细胞、成骨细胞和破骨细胞[5]。同时，EphrinB2和EphB4的表达可能受到机械应力的调节，进一步提示了它们在正畸力诱导的牙齿移动过程中可能具有调节作用。考虑到OTM也是机械应力下成骨和破骨细胞生成的耦合过程，本研究旨在探讨EphrinB2-EphB4信号在OTM过程中是否参与牙槽骨重塑。首先，我们在大鼠模型中探索OTM期间压力侧EphrinB2-EphB4信号的变化。然后，通过局部抑制EphB4活性验证了EphrinB2-EphB4信号在牙槽骨重塑中的重要调节功能。

1 材料与方法

1.1 实验动物本研究于2021年10月至2022年1月，从上海实验动物研究中心获得60只6周大的雄性Wistar大鼠，体重(200±10) g，饲养于本院实验动物中心。适应2天后，参照文献方法建立OTM动物模型[5]。使用固定在左上颌第一磨牙和门牙之间的3M Unitek镍钛螺旋弹簧(美国CA公司)产生100 g的力来诱导牙齿移动。插入后立即激活设备，每天检查弹簧。在实验期间没有进行重新激活。为了考察在OTM过程中EphrinB2-EphB4信号在压力侧表达情况，将24只大鼠分为应用正畸螺旋弹簧的前一天(第0天)和OTM牙齿移动后3、7、14天组，每组6只。在规定的时间处死大鼠，采集包括第一磨牙在内的左上颌骨块用于免疫印迹分析以及免疫组织化学分析。然后将其余36只大鼠分为对照组、OTM组和EphB4抑制剂(NVP-BHG712)组，每组12只。对照组应用相同未激活的正畸矫治器。OTM组和NVP-BHG712组建立OTM模型。NVP-BHG712组从应用正畸螺旋弹簧的第1天开始在左上颌第一磨牙附近牙周组织的颊舌侧皮下注射NVP-BHG712(美国APExBIO公司)，剂量为20 μl，浓度为4 μmol，连续治疗14天；对照组和OTM组只接受载体(0.1%乙酸)。在第14天处死所有大鼠，并收获包括左上颌第一磨牙的牙槽骨块、上颌骨和牙周组织用于微型计算机断层扫描(Micro-CT)分析和组织学分析。

1.2 方法

1.2.1测量牙齿移动的距离 牵引14天后，使用inspeXio SMX-100CT微焦点X射线系统(日本SHIMADZU公司)进行微CT成像。成像条件为管电压75 kV，管电流140 μA，阈值设置为212～1000。使用3DBon(日本Ratoc System Engineering Corporation公司)测量牙齿移动的距离。该距离定义为活动牙釉质最远点与第二磨牙最近中点之间的直线距离。同时，记录骨体积/组织体积比值、骨密度、骨小梁数、骨小梁厚度和骨小梁间隙。

1.2.2组织学分析 取出上颌骨并在4 ℃ 4%中性缓冲福尔马林中固定48 h。样品在10% EDTA溶液(pH 7.4)中脱矿4周。脱矿质标本在流水下冲洗，按常规方法制备石蜡包埋块，从磨牙制备约6 μm厚的横切面，进行苏木精和伊红(H&E)染色和使用市售试剂盒(VECTASTAIN ABC-AP Kit(美国Vector Laboratories公司)进行免疫染色，检测EphrinB2和EphB4蛋白的表达。切片脱蜡，室温下用含有0.3% Triton X-100的PBS处理20 min，然后浸入3%过氧化氢中以阻断内源性过氧化物酶活性。2%正常山羊血清处理切片30 min，与一抗在PBS中室温孵育1 h。与辣根过氧化物酶缀合的抗兔IgG抗体在室温下孵育30 min并通过DAB显色。使用Image-Pro 6.1软件对染色进行量化。

1.2.3蛋白质印迹分析 将获得的组织在液氮环境中彻底研磨，并在4 ℃下用RIPA裂解30 min。 收获组织并在4 ℃和12000 rpm下离心30 min。每组取20 μg蛋白质在10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离并转移到聚偏二氟乙烯膜(美国Millipore公司)上。用含有0.1% Tween-20和5%脱脂牛奶的Trisbuffered缓冲液封闭膜，然后在4 ℃下与EphrinB2 (1∶1000)、EphB4 (1∶1000)和GAPDH (1∶20000)孵育过夜。将膜用TBST洗涤3次，并与山羊抗鼠或抗兔HRP偶联的二抗(1∶20000)在室温下孵育1 h。TBST洗涤3次后，用化学发光系统检测条带。使用Image-Pro 6.1软件对暴露的蛋白质条带进行量化。

1.2.4实时定量聚合酶链反应(qPCR) 取出第一磨牙，剥除周围组织进行研磨并储存在液氮中。使用TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)提取总RNA。通过测量260/280比率来检测总RNA的质量，并在260 nm处记录吸光率。然后使用转录第一链cDNA合成试剂盒(日本Takara公司)将RNA逆转录为cDNA。反应条件如下：37 ℃ 15 min，85 ℃加热5 s，最后冷却至4 ℃。使用SYBR Green PCR Master Mix和LightCycler 96 Instrument (上海Roche公司)检测mRNA表达。采用GAPDH作为管家基因。引物序列见表1。

表1 本研究中使用的引物序列

1.3 统计学方法采用GraphPad Prism(8.0版)软件进行数据分析。计量数据表示为均数±标准差，应用方差分析进行比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OTM过程中EphrinB2-EphB4信号在压力侧表达情况与第0 d比较，在OTM第4、 7、 14 d时EphrinB2和EphB4蛋白表达增加，在第7 d时达到峰值，并在第14 d略有下降。见图1。

图1 免疫印迹检测OTM过程中EphrinB2-EphB4蛋白在压力侧表达情况

2.2 EphB4抑制OTM并增加骨密度与OTM组(301.43±44.64) μm比较，NVP-BHG712组第一磨牙和第二磨牙的距离(164.08±30.79) μm显著降低(P<0.05)。见图2。与对照组比较，OTM组骨体积/组织体积比值、骨密度、骨小梁数、骨小梁间隙均显著降低，骨小梁厚度显著增加(P<0.05)。NVP-BHG712组的骨体积/组织体积比值、骨密度、骨小梁数、骨小梁间隙较OTM组显著增加，骨小梁厚度显著降低(P<0.05)。见表2。

图2 各组大鼠在OTM第14天后第一和第二磨牙的显微CT图像(n=6) M1：第一磨牙；M2：第二磨牙

表2 骨微结构的定量评估(n=6)

2.3 EphB4抑制影响OTM期间牙周韧带的形态HE染色可见对照组第一磨牙牙周形态规则，细胞排列有序，而OTM组牙周形态不规则，空泡结构大，细胞排列无序。与OTM组比较，NVP-BHG712组牙周膜形态较对照组紊乱，但空泡较OTM组少，提示EphrinB2-EphB4信号抑制可影响牙周膜形态。见图3。

图3 上颌第一磨牙根三叉区牙周膜镜下表现 a:对照组；b:OTM组；c:NVP-BHG712组(HE染色，×40) PDL：牙周韧带；AB：牙槽骨

2.4 EphB4抑制影响牙周组织中的炎症相关基因与对照组比较，OTM组第一磨牙牙周组织中IL-1、IL-6和TNF-α的表达均显著增加(P<0.05)。与OTM组比较，NVP-BHG712组IL-1、IL-6和TNF-α的表达均显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 OTM过程中各组牙周组织炎症相关基因IL-1、IL-6和TNF-α的mRNA表达比较(n=6)

3 讨论

Ephrin-Eph信号通过改变细胞骨架参与介导细胞迁移和细胞粘附[6]。最近，越来越多的研究报道了EphrinB2-EphB4信号在调节骨稳态中的作用[7，8]。OTM与牙槽骨的重塑相结合，表明该过程也参与了机械负荷下骨稳态的调节。在牙齿运动的压力侧，骨形成活动在机械负荷下占主导地位，这与EphrinB2-EphB4信号在骨稳态中的作用是一致的。因此，本研究探讨了EphrinB2-EphB4信号在机械力诱导OTM中的作用。机械力过小不能达到牙齿移动的效果，力过大会引起牙根吸收，牙槽骨吸收过多，从而产生诸多副作用。因此，选择合适的力模型是OTM模型成功的关键因素之一。一项研究表明，100 g的力可以促进破骨细胞募集，正畸牙齿移动，并且没有牙根吸收，表明100 g的力是大鼠OTM模型中最理想的力[5]。因此，本研究对大鼠施加100 g的力，建立OTM模型，模拟最佳临床生理OTM。我们发现对照组在正畸力施加过程中EphB4的表达上调。EphB4的表达在牙齿移动7天后达到峰值，在第14天仅略有下降。同样，EphrinB2的表达在实验过程中表达与EphB4的变化趋势一致。结果表明，牙周组织中EphrinB2-EphB4信号的表达在压力作用下升高。我们推测EphrinB2-EphB4信号的激活可能有助于OTM期间的牙槽骨重塑。

既往研究在大鼠体内建立了相同的OTM模型，将注射EphB4抑制剂NVP-BHG712注射到大鼠牙周局部，可以有效抑制牙周膜的EphB4信号水平[9]。因此，本研究遵循之前的药物应用，并选择了解剖学上是明确定义的三叉区来检测骨密度[10]，结果显示OTM会引起牙周膜结构的改变和根部三叉处细胞排列的紊乱。EphB4抑制后，牙周膜排列整齐，空泡明显减少，炎症细胞减少，提示EphrinB2-EphB4信号可能影响OTM牙周膜形态。

研究表明，炎症是宿主对组织损伤的局部反应，是对微生物物质入侵以及化学和物理刺激的反应[11～13]。在OTM的生理过程中，炎症反应很明显。牙周韧带受压后，局部血流减少，白细胞迁移到血管外空间，炎症反应扩散到更广泛的组织区域，并被多种内源性化学介质放大[14]。血管和细胞的炎症变化是由正畸牙齿的牙周组织中检测到的许多生化物质介导和维持的，以刺激或抑制自分泌或抑制细胞活动。已知IL-1、IL-6和TNF-α是促炎细胞因子，可诱导各种蛋白质的合成，从而引起急性或慢性炎症[14～16]。此外，它们还参与了OTM的过程[17]。本研究结果表明，OTM后IL-1、IL-6和TNF-α的表达增加，其他研究也证明大鼠和小鼠OTM后牙周组织IL-1、IL-6和TNF-α的表达增加[18]，而EphB4抑制后炎症因子IL-1、IL-6和TNF-α的表达减少。这可能是因为EphrinB2-EphB4信号可以调节牙周相关疾病的发作，干扰继发性免疫和炎症，并调节其他类型的细胞死亡[19，20]。

总之，本研究证明了牙周膜的EphB4抑制减少了骨密度的下降，抑制了炎症因子的表达，使牙周膜在OTM过程中有序排列，为开展有效的临床正畸治疗和调控炎症提供了有益的途径，进而实现更高效、更健康的牙齿移动。然而，EphrinB2-EphB4信号影响炎症的具体机制有待进一步探索。