裴明财，曾涵芳，林 红，朱 靖，韩兆玉

(南京农业大学 动物科技学院/乳牛科学研究所，江苏 南京 210095)

蛋氨酸 (methionine，Met)，化学名为2-氨基-4-甲硫基丁酸，在奶牛的生长和泌乳过程中，被认为是第一限制性氨基酸，对蛋白质的合成起着至关重要的作用[1]。然而，由于奶牛特殊的瘤胃代谢途径，直接投喂蛋氨酸易被瘤胃微生物降解，只有少量的Met能够到达真胃和小肠[2]。因此，保护型Met成为优化奶牛日粮营养平衡，提高泌乳功能和生产性能的重要手段[3]。蛋氨酸羟基类似物异丙酯(HMBi)，是以2-羟基-4-甲硫基丁酸(HMB)和醇为原料进行酯化反应而制成的一种过瘤胃Met产品[4]。HMBi在体内的吸收途径主要分为3种，一种是经瘤胃上皮细胞吸收进入血液循环；一种是被瘤胃微生物降解利用；一种是过瘤胃后在小肠部位被吸收[3]。HMBi被吸收进入肝脏后水解为HMB和异丙醇，然后转化为Met和丙酮[5]。本试验旨在从围产前期开始添加HMBi，研究其对奶牛产奶性能、繁殖性能以及血清生化指标的影响，为HMBi在奶牛生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料HMBi 由上海某公司提供，是一种流动性好的米白色粉末状物质，化学分子结构式为CH3S-(CH2)2- CH(OH)-COO-CH-(CH3)2，由吸附在二氧化硅上的2-羟基-4-甲硫基丁酸异丙酯组成，HMBi最低含量57%。

1.2 试验设计与日粮配方试验根据年龄(3.45±0.23)、胎次(1.15±0.17)、配种后时间(251.55±6.95) d和上一胎产奶量(29.18±1.20)kg/d相一致的原则，选取40头健康的中国荷斯坦奶牛，随机分为对照组和试验组，每组20头，每组5个重复，每个重复4头奶牛，对照组按照原配方日粮饲喂；试验组在对照组基础上，从围产前期开始添加HMBi(添加量为25 g/头/d)，HMBi混匀在275 g玉米粉中，每天饲喂2次。本实验室在前期试验中发现，奶牛日粮中添加一定量的HMBi，能够提高奶牛产奶量，改善乳成分，本试验根据奶牛日粮配方及营养含量，结合奶牛生产需求，计算得出HMBi的添加量为25 g/d。试验期从产前21 d到产后80 d。试验于2019年10月至2020年1月在石家庄市某养殖场进行。基础和试验日粮组成及营养水平分别见表1～3。

表1 围产期基础日粮组成及营养水平(干物质基础) %

表2 泌乳前期基础日粮组成及营养水平(干物质基础)%

表3 试验日粮水解氨基酸含量 g/100 g

1.3 样品采集与测定

1.3.1产奶量和乳成分测定 奶牛分娩后2周开始测定产奶量和乳成分，每天记录每头奶牛产奶量，每2周取1 d奶样(早晨∶晚上=4∶6)共50 mL混合均匀，加防腐剂后冰袋保存迅速带回南京农业大学乳品检测中心，使用全自动乳成分分析仪(MilkoScan-FT120)测定乳成分，乳成分指标包括乳脂率、乳蛋白率、乳糖、非脂固形物、体细胞数和乳尿素氮(MUN)。

1.3.2干物质采食量测定 每2周测定1 d每组奶牛2次日粮采食量，根据日粮干物质含量计算群体干物质采食量，每2周取1次饲料样品测定营养物质含量。

1.3.3繁殖指标测定 产后观察每组奶牛发情情况，记录每组奶牛分娩和产后配种情况，记录每头分娩犊牛初生体质量，记录每头奶牛产后患病情况。

1.3.4血样采集和测定 试验奶牛产后30，60 d分别尾静脉采血10 mL，分离血清，-20℃保存。测定指标：血清白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、总蛋白(TP)、血清尿素氮(BUN)、总氨基酸(TAA)；抗氧化指标：谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)和乳酸脱氢酶(LDH)；血液生殖激素：雌二醇(E2)、促卵泡素(FSH)。血清生化指标由迈瑞BS-350S全自动生化分析仪和(1804397S)酶标仪测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所；生殖激素使用放射免疫的方法检测(XH6080放免仪)。

2 结果

2.1 HMBi对奶牛产奶量和乳成分的影响由表4可知，和对照组相比，试验组产后1～30 d奶牛产奶量增加0.77 kg/d，差异显著(P<0.05)；乳脂率提高0.14%、乳蛋白率提高0.14%、乳糖率提高0.04%、非脂固形物提高0.59%，但差异不显著(P>0.05)；MUN增加18.6 mg/L，(P=0.053)；体细胞数降低0.97×104个/mL，但差异不显著(P>0.05)。与对照组相比，试验组产后31～60 d产奶量增加0.92 kg/d，差异极显著(P<0.01)；乳脂率提高0.05%、非脂固形物提高0.06%、MUN增加6.3 mg/L，但均差异不显著(P>0.05)；乳糖率升高0.15%，差异显著(P<0.05)；体细胞数降低18.58×104个/mL，差异极显著(P<0.01)。与对照组相比，试验组产后1～60 d奶牛产奶量增加0.84 kg/d，差异极显著(P<0.01)；乳脂率提高0.08%，乳蛋白率提高0.03%，非脂固形物提高0.24%，但均差异不显著(P>0.05)；乳糖率提高0.11%，差异显著(P<0.05)；MUN增加10.5 mg/L，差异显著(P<0.05)；体细胞数降低12.71×104个/mL，差异显著(P<0.05)。

表4 HMBi对奶牛产奶量和乳成分的影响

2.2 HMBi对奶牛血清蛋白相关指标的影响由表5可知，与对照组相比，试验组产后30 d，ALB增加2.01 g/L、TAA增加2.5 μmol/L，但均差异不显著(P>0.05)；GLB增加3.12 g/L，差异显著(P<0.05)；TP增加5.13 g/L，差异极显著(P<0.01)；BUN增加1.83 mmol/L，差异极显著(P<0.01)。与对照组相比，试验组产后60 d，ALB增加3.84 g/L，差异极显著(P<0.01)；GLB增加2.75 g/L，差异显著(P<0.05)；TP增加6.59 g/L，差异极显著(P<0.01)；BUN增加1.12 mmol/L，差异显著(P<0.05)；TAA增加5.02 μmol/L(P=0.052)。

表5 HMBi对奶牛血清蛋白相关指标的影响

2.3 HMBi对奶牛血清抗氧化指标的影响由表6可知，与对照组相比，试验组产后30 d MDA降低1.1 μmol/L，差异极显著(P<0.01)；GSH-Px增加29.44 U/mL，差异极显著(P<0.01)；SOD增加4.43 U/mL，差异显著(P<0.05)；T-AOC增加0.12 mol/L，差异极显著(P<0.01)；LDH降低37.34 IU/L，差异显著(P<0.05)。与对照组相比，试验组产后60 d MDA降低1.21 μmol/L，差异显著(P<0.05)；GSH-Px增加20.71 U/mL，差异显著(P<0.05)；SOD增加1.81 U/mL，差异显著(P<0.05)；T-AOC增加0.10 mol/L，差异显著(P<0.05)；LDH降低22.67 IU/L，但差异不显著(P>0.05)。

2.4 HMBi对奶牛繁殖性能和血清激素水平的影响由表7可知，与对照组相比，试验组产后30 d FSH增加0.66 IU/L，差异显著(P<0.05)；E2增加2.94 ng/L，但差异不显著(P>0.05)；与对照组相比，试验组产后60 d FSH降低0.11 IU/L，但差异不显著(P>0.05)；E2增加7.88 IU/L，但差异不显著(P>0.05)。试验期间，试验组和对照组奶牛各产犊20头：试验组产12头公牛，8头母牛；对照组产9头公牛，11头母牛。与对照组相比，试验组公犊牛体质量增加3.73 kg，差异极显著(P<0.01)。与对照组相比，试验组总受胎率增加5%，第一情期受胎率增加10%，情期受胎率增加5.02%，配种指数降低0.56。

表6 HMBi对奶牛血清抗氧化指标的影响

表7 HMBi对奶牛繁殖性能和血清激素水平的影响

2.5 HMBi对奶牛产后健康的影响由表8可知，与对照组相比，试验组胎衣不下比例降低25%，子宫炎患病率降低10%；妊娠毒血症患病率降低30%；对照组有1头患酮病，试验组有1头患临床乳房炎；对照组流产2头，试验组流产1头。

表8 HMBi对奶牛产后健康的影响

3 讨论

3.1 HMBi对奶牛产奶量和乳成分的影响产奶量是评定奶牛生产性能的一项重要指标，也是衡量牧场经济效益的直接指标[6]。本试验结果表明，在奶牛日粮中添加25 g/d的HMBi可以显著提高产后1～30，31～60，1～60 d的产奶量。蛋白质是泌乳奶牛日粮的主要限制性营养成分之一，蛋白质营养的实质和核心是氨基酸营养[7]。Met是奶牛泌乳和乳蛋白合成的主要限制性氨基酸，添加过瘤胃Met能够平衡日粮氨基酸水平，提高蛋白质利用效率[8]。HOLTER等[9]在奶牛日粮中添加Met羟基类似物，显著提高了产后1～12周的产奶量。杨保奎等[10]在奶牛产前21 d日粮中添加20 g/d，产后添加30 g/d HMBi，奶牛产奶量提高了6.83 kg/d，与本试验结果相似。

牛奶的营养价值取决于其中的乳脂、乳蛋白、乳糖、矿物质和微量元素[11]。乳脂率是衡量牛奶质量的重要指标，其主要成分是甘油三酯(95%)，另有少量的游离脂肪酸和胆固醇；其中，有近一半的乳脂是以瘤胃发酵产生的丁酸和 β-羟丁酸合成，其余部分则由饲料中的脂肪或积蓄的体脂肪供给[12]；并且乳脂率产量与产奶量呈负相关[13]。乳蛋白含有人体所需的必需氨基酸，具有较高的营养价值，是牛奶的主要营养成分之一[14]。乳中90%以上的蛋白质是在乳腺中由氨基酸从头合成的，乳蛋白合成所需要的蛋白质占蛋白质总需要的70%，酪蛋白是乳蛋白的主要成分[15]。乳糖是牛奶中主要的双糖，也是泌乳过程中重要的渗透调节因子[16]，增加乳糖合成可以进一步增加产奶量[17-18]。本试验结果表明，在奶牛日粮中添加25 g/d的HMBi，显著提高了产后31～60，1～60 d牛奶的乳糖率，乳脂率、乳蛋白率有上升的趋势。可能是日粮中添加HMBi促进了乳糖的合成，最终引起产奶量的提高。FAHEY等[19]研究发现，奶牛日粮中添加Met羟基类似物，可以显著提高总产奶量、总脂肪产量和总乳糖产量。XIA等[20]研究发现，在奶牛日粮中添加HMBi，产前10 g/d，产后18 g/d，可以提高奶牛产奶量、乳脂率、乳蛋白率和乳糖率。

牛奶的成分主要是水和固形物，固形物包括脂肪、蛋白质、乳糖、矿物质和维生素等，其成分含量的多少，影响着牛奶的质量，非脂固形物是除脂肪外的固形物[12]。MUN可用于监控奶牛日粮的蛋白质水平、能氮平衡和氮利用率[21]。JOHNSON等[22]研究发现MUN值与乳蛋白含量、乳脂含量和体细胞数呈负相关。郭同军等[23]研究发现，与鲜样比较，冷冻保存和防腐剂保存的乳样MUN含量显著升高,乳蛋白含量下降。本试验结果表明，在奶牛日粮中添加25 g/d的HMBi，非脂固形物有上升的趋势,产后1～60 d MUN显著上升。可能是饲料中的能氮不平衡，导致瘤胃降解蛋白质较多，没有被有效利用，造成日粮氮从乳汁中排出。OLTNER等[24]研究发现，影响乳尿素的主要因素不是蛋白质摄入量与需要量的关系，而是日粮中蛋白质与能量的关系。

牛奶体细胞数(SCC)是指每毫升牛奶中所含有体细胞的数量，SCC与乳成分、日产奶量和产奶量呈显著负相关[25]。体细胞数是牛奶重要的健康指标，可以间接反映奶牛乳房健康状况，当奶牛乳房发生炎症反应时，体细胞数可以用来反映乳房炎症的严重程度[26]，一般当牛奶中体细胞数超过20×104个/mL 时，奶牛乳房疑似受到细菌感染[27]，而当体细胞数超过50×104个/mL时，奶牛乳房炎的发病率将会大大增加[28-29]。本试验结果表明，在奶牛日粮中添加25 g/d的HMBi，产后31～60，1～60 d牛奶中体细胞数显著下降。可能是添加过瘤胃Met，奶牛免疫力提高。杨保奎等[10]研究发现，在日粮中添加HMBi可以提高奶牛的产奶量，降低体细胞数，与本试验结果相似。

因此，在奶牛日粮中添加HMBi可以提高奶牛泌乳前期产奶量，改善乳成分，降低患乳房炎的风险。

3.2 HMBi对奶牛血清蛋白相关指标的影响血清TP、ALB的含量可以反映机体蛋白质的吸收和代谢状况，它们的含量升高说明动物的蛋白质合成代谢速度快；此外，血清GLB含量可以反映机体的免疫能力[30]。本研究结果表明，在奶牛日粮中添加25 g/d的HMBi，显著提高了奶牛产后30 d血清中GLB、TP含量，ALB有上升的趋势；产后60 d血清中ALB、GLB、TP含量显著增加。可能是日粮添加HMBi后，增加了血清中的游离氨基酸含量，促进了ALB、GLB、TP的合成。张仔堃等[31]研究发现，在奶牛日粮中添加过瘤胃Met可以提高TP、ALB、GLB含量，降低BUN含量。HAN等[32]研究发现，奶牛日粮中添加15 g/d的HMBi可以提高血清中TP和ALB含量。

BUN是机体氮代谢的重要指标，通常受瘤胃中氨态氮浓度的影响，同时也受小肠内氨基酸平衡的影响，能够较准确地反映机体蛋白质合成代谢及氨基酸平衡状况[33]。血清BUN含量是反映动物机体蛋白质代谢状况的一个重要指标，用于衡量机体蛋白质的沉淀情况，在日粮蛋白质水平稳定的情况下，血清 BUN含量较低表明其他部位的蛋白质沉积率高，过高时会使氮通过尿液排出体外，从而降低氮的利用率[34]。肝脏是氨基酸的代谢的主要器官，血清 TAA 能够在一定程度上反映蛋白质及氨基酸的代谢状况，且能体现出肝脏的健康状况[35]。本试验结果表明，在奶牛日粮中添加25 g/d的HMBi，显著提高了产后30，60 d血清中的BUN含量，TAA有上升的趋势。血浆尿素浓度与乳中尿素浓度的相关系数为0.98[24]，本试验中BUN、MUN都显著升高，有可能是饲料中的能氮不平衡，导致瘤胃降解蛋白质较多，没有被有效利用，造成日粮氮以尿素氮形式排出。唐波等[36]研究发现，在犊牛精料补充料中添加4 g/d的HMBi，对TP、ALB、GLB无显著影响，BUN显著降低。郗伟斌等[37]在奶牛日粮中补充 HMBi 对奶牛血清TAA、BUN都没有显著影响。PIEPENBRINK等[38]研究发现，奶牛饲喂过瘤胃Met可以增加BUN和Met含量。

因此，在奶牛日粮中添加HMBi可以加快奶牛机体蛋白质合成和代谢速率，增强机体免疫力。

3.3 HMBi对奶牛血清抗氧化指标的影响GSH-Px、SOD和T-AOC是衡量生物机体内抗氧化能力的重要指标，可降低自由基对机体的毒害程度。MDA是脂质过氧化标志物，检测MDA的浓度不仅可以判断脂质过氧化程度，还可作为乳腺炎的诊断指标[39]。泌乳早期的奶牛，机体器官代谢增强，氧消耗量增加使得氧自由基量增加，超过机体清除能力，容易造成氧化应激[40]。有研究表明，HMBi可以提高机体血液中的Met含量，Met可以通过先转化成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，再由SAM转化成半胱氨酸(Cys)的途径合成谷胱甘肽(GSH)，GSH可通过其还原型巯基参与体内氧化还原反应，加速自由基的清除，提高抗氧化酶的活力[41]。当机体的抗氧化能力增强时，血清中GSH-Px、SOD、T-AOC活性会随之升高，MDA含量则降低。本试验结果表明，试验组产后30，60 d血清中GSH-Px、SOD、T-AOC均显著升高，MDA含量均显著降低，并且随着饲喂时间的增加，此种趋势一直延续。奶牛产后面临很多外界应激，饲喂HMBi后增加了血清中游离氨基酸浓度，促进了抗氧化酶的合成，最终提高了机体抗氧化能力，有效抵抗应激。唐波等[41]研究发现，在肉牛精料中添加8 g/d的HMBi，血清中GSH-Px和SOD在试验后分别比对照组提高9.2%和2.10% ，MDA下降7.17%。王群等[42]研究发现，在奶牛不同蛋白质水平添加29.9 g/d的HMBi，可以提高血清SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量。HAN等[32]研究发现，奶牛日粮中添加25 g/d的HMBi可以提高血清中GSH-Px活性。周国波[43]研究发现，在热应激奶牛日粮中添加 13 g/d的HMBi 能显著提高血清中GSH-Px和SOD活性，降低MDA含量。

研究表明，LDH活性与奶牛患隐性乳房炎存在一定的相关性，LDH活性越高，隐性乳房炎越严重[44]。LDH是糖酵解和糖异生过程中催化乳酸和丙酮酸之间氧化还原反应的重要酶类[45]，该酶活性的降低表明体内供能方式从无氧向有氧方向的转化。本试验试验组产后30 d乳酸脱氢酶活性显著降低，产后60 d乳酸脱氢酶活性有降低的趋势，与产后30 d体细胞数降低的趋势互相验证，表明在奶牛日粮中添加HMBi可以增加机体有氧供能，进一步降低奶牛患乳房炎的风险。

因此，在奶牛日粮中添加HMBi可以提高抗氧化能力，有效抵抗外界应激。

3.4 HMBi对奶牛繁殖性能和血清激素水平的影响FSH是垂体分泌的一种糖蛋白类激素，可调节性腺激素的合成和分泌，促进卵泡生长到排卵时的体积[46]，以达到超排的目的[47-48]。E2是卵巢内膜细胞、颗粒细胞和胎盘等细胞分泌的一种类固醇激素，分娩期可与OXT协同，参与分娩发动；泌乳期与PRL协同促进乳腺发育和乳汁分泌。第一情期受胎率是第一情期妊娠母畜数占第一情期配种的母畜数的百分比；配种指数是畜群平均每次受胎所需的配种情期数或次数，或参加配种母畜平均每次妊娠的配种情期数。本试验结果表明，试验组产后30 d FSH显著上升，E2有上升的趋势，产后60 d FSH、E2都有上升的趋势；后代公犊牛体质量显著增加；第一情期受胎率增加10%；配种指数降低0.56。王长宏等[49]研究发现，奶牛日粮中添加蛋氨酸锌可以改善奶牛的分娩率，增加犊牛初生体质量的趋势，使奶牛产后发情提前。马吉锋等[50]研究发现，奶牛日粮中添加蛋氨酸锌可以提高第1次配种妊娠率和总受胎率。周帅等[51]研究发现，奶牛日粮中添加HMBi可以降低奶牛配种次数，提高第一情期受胎率高。

因此，在奶牛日粮中添加HMBi可以改善奶牛繁殖性能。

3.5 HMBi对奶牛产后健康的影响奶牛分娩后，机体内分泌、营养代谢、生理状态等方面都发生很大的变化，这些生理应激容易引发各种疾病[52]。本试验结果表明，试验组产后胎衣不下、子宫炎、妊娠毒血症、代谢性疾病患病率下降。ARDALAN等[53]研究发现，在奶牛日粮中添加18 g/d的过瘤胃Met，可以提高受胎率、降低总发病率，可改善奶牛的繁殖性能和健康状况，本试验与此结果相似。

因此，在奶牛日粮中添加HMBi可以改善奶牛产后健康状况。

综上所述，日粮中添加25 g/d的HMBi可以提高奶牛产奶量、改善乳成分和繁殖性能，加快机体蛋白质代谢速率，提高抗氧化能力，降低产后疾病发生率。HMBi可以作为奶牛常用饲料添加剂，有益于奶牛的健康养殖。