吴 丹，罗润波，黄家旗，蔡重振，卓玛次仁，王萌浩，袁国意，张梦晨，李 彬，宋仁德，索朗斯珠*

(1.西藏农牧学院 动物科学院，西藏 林芝 860000；2.江苏农业科学院 兽医研究所，江苏 南京 210014；3.国家肉牛牦牛产业技术体系 玉树综合试验站，青海 玉树 815000)

产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens，C.perfringens，Cp)旧名魏氏梭菌(C.welchii)，属于梭菌属，革兰阳性、产芽胞的大杆菌，常单个或成双存在，常见于土壤、污水、沉积质、腐殖质、食物、粪便、人和其他脊椎动物肠道中[1]。产气荚膜梭菌所产生的毒素是其致病的主要原因，通常可引起人和动物气性坏疽(gas gangrene)、食物中毒、羔羊痢疾(lamb dysentery)、绵羊猝疽(struck)、牛肠毒血症(enterotoxemia in cattle)和坏死性肠炎(necrotizing enteritis)等疾病[2]。牦牛源产气荚膜梭菌能引起牦牛猝死综合征[3]，病畜通常临床表现出腹部鼓气胀大，心脏、肝脏、脾脏、肾脏等实质器官出血性病变，急性出血性肠炎[4]，以及突然倒地死亡等症状，发病急，病程短，严重影响着牦牛养殖业的经济发展[5]。本试验以1株牦牛源产气荚膜梭菌为研究对象，通过生化试验、药敏试验、MIC测定以及全基因组测序等方法，对该菌进行基因组生物信息学分析、部分生物学特性研究以及探究其耐药特性，为进一步了解牦牛源产气荚膜梭菌基因功能、耐药特性提供了理论参考。

1 材料与方法

1.1 菌株来源在2020年夏末秋初，青海玉树地区多地牦牛出现腹胀、腹泻等症状，对死亡牦牛剖检发现胃、肠道出血。在青霉素、链霉素、庆大霉素、复方新诺明等药物的治疗下未取得好的治疗效果，西藏农牧学院预防兽医实验室采集新鲜腹泻粪样，并从中分离得到牦牛源产气荚膜梭菌Qinghai-1菌株。

1.2 主要试剂及仪器DNA聚合酶、dNTPs、DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；无菌脱纤维绵羊血购自北京Solarbio科技有限公司；厌氧产气袋购自日本Mitsubishi Chemical公司；生化鉴定管购自杭州微生物有限公司；MIC试纸购自意大利Liofilchem公司；胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基(TSC)、羊血琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基(MACC)、液体硫乙醇酸盐培养基(FTG)、梭菌增菌培养基(RCM)、含铁牛乳培养基、LB培养基(LB)、微生物药敏试验专用培养基(MH培养基)购自青岛海博生物技术有限公司；凝胶成像系统购自上海天能科技有限公司；PCR仪购自美国Applied Biosystems公司。

1.3 菌株复苏将冻存的Qinghai-1菌株缓慢梯度升至室温(-80℃→-20℃→4℃→室温)，依次划线接种于羊血琼脂培养基、TSC培养基、MACC培养基，41℃厌氧培养18～24 h。挑单菌落接种于FTG、含铁牛乳培养基，石蜡油液封，41℃培养12 h。革兰染色后，利用显微镜对细菌进行镜检。

1.4 全基因组DNA提取及PCR扩增挑单菌落接种于RCM培养基中，石蜡油液封，41℃培养12 h，利用细菌基因组试剂盒提取Qinghai-1菌株全基因组DNA。合成细菌16S rRNA通用引物[6]、产气荚膜梭菌常见毒素分型基因引物[7]分别对菌株DNA进行PCR扩增，扩增采用50 μL体系，引物信息见表1。PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，并通过凝胶成像系统拍照保存。

表1 PCR引物信息

1.5 生化特性分析参考伯杰细菌鉴定手册[8]，将对数生长期的菌液分别接种于硫化氢、吲哚、乳糖、鼠李糖、靛基质、木糖、纤维二糖、棉子糖、葡萄糖、麦芽糖、水杨苷、甘露醇、山梨醇、尿素、蔗糖、酪蛋白、脂酶、赖氨酸、鸟氨酸、硝酸盐、明胶、阿拉伯糖、卵磷脂酶、甘露糖等24种细菌生化鉴定管对Qinghai-1菌株进行生化特性研究。

1.6 药敏试验与最低抑菌浓度(MIC)测定调整菌液浓度为0.5个麦氏浊度(1×108～2×108CFU/mL)，均匀涂布于MH培养基上，采用E-test法[9]和Kirby-Bauer纸片扩散法测定Qinghai-1菌株对10种常用抗菌药物(头孢噻肟、氨苄西林、庆大霉素、复方新诺明、青霉素、四环素、多黏菌素B、红霉素、链霉素、杆菌肽)的MIC及抗菌药物的敏感性。读取MIC纸条环尖所对应纸条上的数值并测量纸片扩散法中抑菌圈大小，根据CLSI推荐的《抗菌药物敏感性试验标准》对测定结果进行判定[10]。

1.7 细菌全基因组测序分析将1.4中提取的细菌全基因组DNA用Qubit Fluorometer和NanoDrop分别检测DNA的浓度和纯度，将质检合格的样品送至擎科生物科技有限公司，并基于Nanopore三代测序技术平台和illumina二代测序技术平台进行测序，再采用Pilon(1.23)[11]软件进行纠错以及Unicycler(0.4.9)[12]软件进行组装。组装完成后利用Prokka(1.13)[13]软件对组装后的全基因组进行编码基因预测，与8大数据库(UniProt[14]、KEGG[15]及 KEGG Pathway、GO[16]、Pfam[17]、COG[18]、TIGERfams[19]、RefSeq、NR)的基因功能做BLAST+(2.9.0+)[20]比对并注释。随后通过Diamond blastp[21]基于VFDB(毒力因子数据库)对目的蛋白质序列进行注释，用于收集Qinghai-1菌株毒力因子的信息；通过CARD[22](耐药基因数据库)网站(http://arpcard.mcmaster.ca)中选择RGI(Resistance Gene Identifier)模式分析Qinghai-1菌株抗性基因及耐药种类。

1.8 上传数据并构建遗传进化树将牦牛源产气荚膜梭菌Qinghai-1菌株全基因组核苷酸序列上传至NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得GenBank 登录号，并通过与其他已公开序列比对，下载相关序列，利用MEGA 7.0软件采用邻接法(Neighbor Joining)构建Qinghai-1菌株遗传进化树。

2 结果

2.1 细菌生长特征将接种好的培养基置于41℃恒温培养箱中，厌氧培养18～24 h，观察并记录细菌及菌落在不同培养基的生长状况(表2)，细菌在不同培养基生长形态见图1A～E。革兰染色镜检结果显示：菌体大小为0.6～2.4 μm×1.3～19.0 μm，其两端钝圆，呈单个或双个排列，有荚膜、无鞭毛的革兰阳性粗大杆菌(图1F)。

表2 不同培养基Qinghai-1菌株生长特征

A.羊血琼脂培养基；B.TSC培养基；C.MACC培养基；D.FTG培养基(左.对照组；右.试验组)；E.含铁牛乳培养基(左.对照组；右.试验组)；F.革兰染色(1 000×)

2.2 细菌 16S rRNA和四重分型PCR扩增结果PCR扩增结果显示，16S rRNA PCR产物凝胶电泳在约1 400 bp处出现条带，四重分型PCR产物凝胶电泳仅在325 bp处出现条带(图2)，与预期条带大小相符合。经测序比对和毒素基因分型得到牦牛源产气荚膜梭菌Qinghai-1菌株为A型产气荚膜梭菌。

M.DL2000 DNA Marker；1.阴性对照；2.牦牛源产气荚膜梭菌Qinghai-1菌株

2.3 生化反应结果生化试验结果显示：Qinghai-1菌株在硫化氢、乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、赖氨酸、鸟氨酸、卵磷脂酶、明胶、硝酸盐、甘露糖、酪蛋白共12种生化鉴定管中呈阳性反应，有产酸产气或生长动力等试验现象出现。在其余12种生化鉴定管中呈阴性反应，生化管中无生化反应现象产生。

2.4 药敏试验及MIC测定结果结果如表3所示，药敏试验与MIC测定结果相同。

表3 常用药物MIC测定结果

2.5 Qinghai-1菌株遗传进化树通过利用MEGA 7.0软件构建Qinghai-1菌株遗传进化树，结果显示，Qinghai-1菌株与中国云南山羊源(MK156683)产气荚膜梭菌处于同一分支，与西藏安多县牦牛源(MN960263、MN960262)产气荚膜梭菌和西藏班戈县牦牛源(MN960261)产气荚膜梭菌却有着相对较远的亲缘关系(图3)。

图3 Qinghai-1菌株16S rRNA遗传进化树

2.6 Qinghai-1菌株基因组序列分析基因组组装结果显示，基因组长度3 042 374 bp，GC含量为28.58%，共含2 906个基因，2 721个CDS区，94段tRNA，10段rRNA，60段miscRNA，1段tmRNA，968段重复序列和1个基因岛，不含CRISPR序列(表4)。利用预测得到的基因组信息，绘制基因组圈图(图4)。

表4 牦牛源产气荚膜梭菌Qinghai-1菌株基因组基本信息

注：由外到内依次：第1圈.基因组序列信息；第2圈.基因组序列的GC含量曲线；第3圈.基因组序列的GC skew曲线；第4圈.二代测序深度及覆盖度信息；第5圈.三代测序深度及覆盖度信息；第6圈.展示了参考基因组中的基因编码区(CDS)以及非编码RNA区(rRNA、tRNA)，以内外两层表示，外层代表正链，内层代表负链

2.7 Qinghai-1菌株基因组功能注释与8大数据库的基因功能比对注释结果显示，UniProt数据库1 721 个基因，KEGG数据库849个基因，KEGG Pathway数据库815个基因，GO数据库1 643个基因，Pfam数据库2 406个基因，COG数据库1 196个基因，TIGERfams数据库1 669个基因，RefSeq数据库2 679个基因，NR数据库2 261个基因(图5)。

注：左侧为通用数据库基因注释统计；右侧为共有和特有统计，上方为数目统计，下方为共有或特有数据库的标注

GO(gene ontology，国际标准化的基因功能分类体系)数据库将Qinghai-1菌株基因的功能分为细胞组分(cellular component)、分子功能(molecular function)、生物学过程(biological process)3个方面(图6)，生物过程的各基因功能数量相对平均，富集程度最高的为翻译过程(translation)共有63个基因；细胞组分的部分基因功能数量差异明显，其中富集程度前3的为质膜(plasma membrane)共384个基因，细胞质(cytoplasm)共376个基因，质膜组成部分(integral component of plasma membrane)共316个基因；分子功能中的ATP结合功能(ATP binding)基因富集程度最高，共320个基因。

注：横坐标为 GO 各分类内容，纵坐标为基因数目

KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库从其对基因产物的代谢途径和功能的不同通路[23]将Qinghai-1菌株基因组基因分为5个大类和28个小类(图7)，其中富集最高的基因代谢途径为代谢类(metabolism)中的碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)共有267个基因。

COG(cluster of orthologous groups of proteins，基因产物直系同源分类)数据库以细菌、藻类、真核生物具有完整基因组的编码蛋白、系统进化关系为构建基础[24]，将Qinghai-1菌株基因组基因分为20类(图8)，其中基因数量富集程度前3位的功能途径是翻译、核糖体结构和生物发生(translation,ribosomal structure and biogenesis)，含145个基因；碳水化合物运输和代谢(carbohydrate transport and metabolism)，含135个基因；氨基酸转运和代谢(amino acid transport and metabolism)，含108个基因。

注：横坐标为 Pathway 分类下注释的基因数目；纵坐标为 Pathway 分类，不同颜色代表所属的不同的大分类

注：横坐标为COG各分类内容，纵坐标为基因数目

2.8 细菌毒力因子注释VFDB数据库对Qinghai-1菌株序列注释结果显示：注释到237个与毒力因子有关的基因，主要包括α毒素基因(plc)、θ毒素基因(pfoA)、κ-毒素基因(colA)、外源-α-唾液酸酶基因(nanl)、α-梭菌蛋白酶基因(cloSI)、唾液酸酶基因(nanH)等毒力相关因子。

2.9 耐药基因注释CARD数据库对Qinghai-1菌株序列注释结果显示(图9)：牦牛源产气荚膜梭菌Qinghai-1菌株仅含有1个耐药性相关基因，即ClostridiumperfringensmprF基因，其主要通过抗生素靶标改变的方式来耐受肽类抗生素，该类抗生素常见的药物有杆菌肽、多黏菌素B、黏菌素、万古霉素、太古霉素、沙拉霉素等。

注：从内到外依次为分析种类、RGI运算方式、耐药种类、耐药基因

2.10 基因组序列登录号牦牛源产气荚膜梭菌Qinghai-1菌株16S rRAN的基因序列登录号为MW980090，全基因组序列登录号为CP092481。

3 讨论

本研究选用由本实验室从青藏高原玉树藏族自治州牦牛腹泻粪样中分离到的1株产气荚膜梭菌为研究对象，通过PCR鉴定其为A型产气荚膜梭菌。对其进行生化试验探究，了解到了牦牛源产气荚膜梭菌能发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖和蔗糖并产酸产气，不发酵甘露醇或水杨苷；能液化明胶，不能消化已凝固的蛋白质等常规生化现象[2,25]，扩宽了牦牛源产气荚膜梭菌生化谱，可为进一步研究牦牛源产气荚膜梭菌代谢产物、代谢方式和代谢条件提供依据。通过E-test法和Kirby-Bauer纸片扩散法相互对照测定Qinghai-1菌株对10种常用抗菌药物的敏感性。结果显示，牦牛源产气荚膜梭菌Qinghai-1菌株对头孢噻肟、氨苄西林、青霉素、四环素敏感，对庆大霉素、复方新诺明、多黏菌素B、链霉素、杆菌肽耐药。通过全基因测序与CARD数据库比对注释可知，牦牛源产气荚膜梭菌Qinghai-1菌株含有mprF抗性基因，能通过对抗生素靶标改变对肽类抗生素产生耐药。根据本次药敏试验结果和耐药基因注释结果推荐在今后的养殖生产中交叉使用β-内酰胺类、四环素类药物对牦牛源产气荚膜梭菌病进行预防和治疗，避免继续使用氨基糖苷类、磺胺类、肽类药物用于治疗产气荚膜梭菌引起的疫病。

Qinghai-1菌株基因组组装结果显示，其基因组长度3 042 374 bp，GC含量为28.58%，共含2 906个基因，2 721个CDS区，94段tRNA，10段rRNA，60段miscRNA，1段tmRNA，968段重复序列和1个基因岛，不含CRISPR序列。GO数据库注释结果显示，生物过程富集程度最高的为翻译过程；细胞组分富集程最高的为质膜；分子功能富集程度最高的为ATP结合功能，通过细胞组分、分子功能、生物学过程3个方面来全面描述了Qinghai-1菌株基因和基因产物的属性。KEGG数据库注释结果显示，富集程度最高的基因代谢途径为碳水化合物代谢，通过5个大类和28个小类共同描述了Qinghai-1菌株基因产物在细胞中的代谢途径以及这些基因产物的功能，可以进一步研究基因在生物学上的复杂行为[26]。COG数据库从宏观认识Qinghai-1菌株的基因功能分布特征上，将Qinghai-1菌株注释到COG数据库的1 196个基因分为20类，其中基因数量富集程度最高的功能途径是翻译、核糖体结构和生物发生。全基因组测序的结果对牦牛源产气荚膜梭菌遗传变异性、基因功能、毒力机制和耐药机制等方向的研究提供理论依据，为分析高原牦牛源产气荚膜梭菌分子生物学特性提供支撑。

VFDB数据库对收集到的Qinghai-1菌株毒力因子注释结果显示，注释到237个与毒力因子有关的基因，主要包括α毒素基因(plc)、θ毒素基因(pfoA)、κ-毒素基因(colA)、外源-α-唾液酸酶基因(nanl)、α-梭菌蛋白酶基因(cloSI)、唾液酸酶基因(nanH)等毒力相关因子。该结果为研究Qinghai-1菌株的致病机制提供了依据。最后，本试验从生物学特性和全基因组测序两个方面完成了对Qinghai-1菌株的耐药特性和基因组信息分析，并将其上传至NCBI基因组数据库获得登录号：CP092481，丰富了产气荚膜梭菌基因库宿主的类型，为进一步了解牦牛源产气荚膜梭菌耐药基因和遗传进化信息提供了理论参考。