张春华，翟爱华

（1.黑龙江八一农垦大学，黑龙江 大庆 163319；2.绥化学院食品与制药工程学院，黑龙江 绥化 152061）

红小豆具有高蛋白、低脂肪、多营养的特点[1]，其含有的多种生物活性物质，如多酚、黄酮等成分，具有抗氧化、降血糖、提高免疫力、抗癌等功效，红小豆是一种药食同源杂粮[2]。红小豆内含人类机体必需的8类氨基酸，含量最大的是赖氨酸（Lys）与谷氨酸（Glu）[3]，为植物蛋白的优质供体。红小豆中的蛋白含量为20.92%～24.00%，高于肉类、鸡蛋、牛奶和禾谷类食物[4]。豆类分离蛋白除了营养价值高、易吸收外，还具有良好的功能性，可以添加到各种食品中[5-7]。提取豆类分离蛋白方面，酶解法、碱溶酸沉法、超滤膜法与超声波辅助法等的应用率很高[8-11]，各具优劣势。

超声波和纤维素酶处理可以分解和破坏植物细胞壁纤维结构，使原料中的蛋白质溶出，以提高蛋白质的提取率。具诸多优势，包括反应条件温和、高提取率、低成本、提取时间少等[12-14]。现多采用多种方法结合，提高提取效率。通过利用超声辅助纤维素酶的方法建立了一种红小豆蛋白质的提取方法。此法可使红小豆蛋白质得率显著提升，改善提取技术，为后续开发应用红小豆蛋白质打下良好基础，在理论上给予借鉴。

1 材料与仪器

1.1 试验材料

红小豆，种子公司出售。

1.2 试验主要仪器和设备

FA2104型电子天平，上海舜宇恒平科学仪器公司产品；DFY-500型高速摇摆式超微粉碎机，温山市林大机械有限公司产品；SH10A型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司产品；PHS-25型数显酸度计，上海伟业仪器厂产品；Scientz-IID型细胞超声破碎仪，宁波新芝公司产品；PS-08A型超声波清洗机，东莞市洁康超声波设备公司产品；TGL-16B型台式高速离心机，湖南星科科学仪器公司产品；DW-86L型超低温保存箱，青岛海尔股份有限公司产品；FD-27型冷冻干燥机，北京德天佑科技发展有限公司产品；K9840型自动定氮仪，济南海能仪器有限公司产品；HYP-1004型消化炉，上海纤检仪器有限公司产品；BGZ-30型电热鼓风干燥器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品；SRJX-4-9型箱式电阻炉，江苏东台县电器厂产品。

2 试验条件和方法

2.1 红小豆常规成分分析

2.1.1 蛋白质含量

参照GB 5009.5—2016测定。

2.1.2水分含量

参照GB 5009.3—2016测定。

2.1.3脂肪含量

参照GB 5009.6—2016测定。

2.1.4灰分含量

参照GB 5009.4—2016测定。

2.1.5上清液中蛋白质含量的测定

参照考马斯亮蓝法[15]。

2.2 工艺流程

首先，利用纤维素酶（50 U/mg）水解红小豆粉，破坏植物细胞壁纤维结构，以增加碱溶酸沉法提取时蛋白质的溶出率。随后进行超声波处理，再利用碱溶酸沉法提取，可大大提高蛋白质的提取率。

其工艺流程如下：

红小豆→清洗浸泡去皮→冷冻干燥→粉碎过筛→石油醚脱脂→脱脂红小豆粉→加纤维素酶处理→超声处理→碱溶酸沉法提取→离心分离→收集上清液→调节pH值至等电点→离心分离→取沉淀物→反复水洗离心→真空冷冻干燥→红小豆蛋白质。

2.3 红小豆蛋白提取率

计算公式如下：

式中：M提取——提取出红小豆蛋白的质量，即上清液中蛋白质的质量，g；

M原料——脱脂红小豆粉的质量，g；

C总蛋白含量——单位质量红小豆中蛋白质的含量，%。

2.4 单因素试验

2.4.1 超声物料浓度选择试验

当超声时间、超声功率、超声温度与酸碱度依次为20 min，400 W，35℃，9.0时，分析不同料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30）对红小豆分离蛋白质得率的影响。

2.4.2 超声功率选择试验

当超声时间、超声温度、料液比、酸碱度依次为20 min，35℃，1∶25，9.0时，分析不同超声功率（100，200，300，400，500 W）对红小豆蛋白质得率状况的影响。

2.4.3 超声时间选择试验

当超声温度、超声功率、料液比与酸碱度依次为35℃，400 W，1∶25，9.0时，分析不同超声时间（10，15，20，25，30 min）对红小豆蛋白质得率的影响。

2.4.4 纤维素酶酶解时间试验

固定加酶量250 U/g，pH值4.8，酶解温度30℃，料液比1∶25，分析不同酶解时间（20，25，30，35，40 min）对红小豆蛋白得率状况的影响。

2.4.5 纤维素酶酶解pH值试验

固定加酶量、酶解时间、酶解温度与料液比依次为250 U/g，35 min，30℃，1∶25，分别在pH值为4.0，4.4，4.8，5.2，5.6的条件下，分析对红小豆蛋白提取率的影响。

2.4.6 酶解温度试验

固定加酶量250 U/g，pH值4.8，酶解时间35 min，料液比1∶25，分别考查在酶解温度为25，30，35，40，45℃的条件下对红小豆蛋白提取率的影响。

2.4.7 加酶量选择试验

固定料液比1∶25，调节pH值至4.8，分别按照100，150，200，250，300 U/g的加酶量加入纤维素酶，置于水浴锅中于30℃温度条件下进行酶解35 min，考查对红小豆蛋白提取率的影响。

2.5 正交试验设计

采取单因素试验，将纤维素酶酶解温度、酶解时间与pH值依次固定为30℃，35 min，4.8，考查指标为提取率，对红小豆蛋白提取效果有显著影响的主要因素超声功率、超声时间、料液比、纤维素酶用量进行L9（34）正交试验。

正交设计因素与水平设计见表1。

表1 正交设计因素与水平设计

3 结果与分析

3.1 脱脂红小豆粉主要成分

脱脂红小豆粉主要成分含量见表2。

表2 脱脂红小豆粉主要成分含量/%

3.2 红小豆蛋白提取影响的因素试验结果

3.2.1 料液比对红小豆蛋白质提取率的影响

料液比对红小豆蛋白提取率的影响见图1。

图1 料液比对红小豆蛋白提取率的影响

由图1可知，料液比同蛋白质得率间的关系，料液比初始为1∶10，随着料液比的提高，红小豆蛋白得率先逐渐提高；当料液比为1∶25时，得率达峰值；当料液比为1∶30时，得率大幅降低。这表明适宜的料液比可以促使蛋白质溶出，再增大料液比，溶液浓度降低，溶质减少，提取率随之下降[12]。因此，在此试验条件下料液比为1∶25最好。

3.2.2 超声功率对红小豆蛋白质提取率的影响

超声功率对红小豆蛋白提取率的影响见图2。

图2 超声功率对红小豆蛋白提取率的影响

由图2可知，在超声功率逐渐增大时，红小豆蛋白得率呈先提高再下降的表现，功率为400 W时，提取率达最大值，这可能是由于超声破碎红小豆的细胞壁使其细胞中的蛋白溶出，提高了蛋白的得率，然而在超声功率〉400 W时，超声会破坏蛋白质的溶出，导致蛋白质变性，使得蛋白质得率下降[14]。

3.2.3 超声时间对红小豆蛋白质提取率的影响

超声时间对红小豆蛋白提取率的影响见图3。

由图3可知，当超声时间处于10～25 min水平，随红小豆蛋白质得率增加呈上升表现，当超声时间为25 min时，蛋白质得率达峰值；但超声时间〉25 min时，红小豆蛋白得率在超声时间提高的同时稍见下降，这是因为超声时间过长，破碎已溶出的蛋白，同时超声时间过长产生热量对蛋白具有破坏作用，所以提取率反而下降[14]。

图3 超声时间对红小豆蛋白提取率的影响

3.2.4 酶解时间对红小豆蛋白质提取率的影响

纤维素酶酶解时间对红小豆蛋白提取率的影响见图4。

图4 纤维素酶酶解时间对红小豆蛋白提取率的影响

由图4可知，酶解时间在35 min时，红小豆蛋白提取率达到最高，随后呈现下降的趋势。这是由于随着酶解时间增加，纤维素酶进一步对破碎后的红小豆细胞壁进行水解，蛋白质溶出，提取率升高；随时间增加，蛋白质变性，凝集沉淀，提取率降低[13]。

3.2.5 酶解pH值对红小豆蛋白质提取率的影响

酶解pH值对红小豆蛋白质提取率的影响见图5。

图5 酶解p H值对红小豆蛋白质提取率的影响

由图5可知，不同的酶解pH值对红小豆蛋白提取率不同，当pH值4.4时，红小豆蛋白提取率最低，因为该pH值位于红小豆蛋白等电点附近，蛋白凝集沉淀，提取率最低；pH值4.8时，蛋白提取率最高，此时纤维素酶活性最大，蛋白质-水相互作用增强，溶解性提高；随pH值增大，纤维素酶活性降低，提取率降低[14]。

3.2.6 酶解温度对红小豆蛋白提取率的影响

酶解温度对红小豆蛋白质提取率的影响见图6。

由图6可知，酶解温度可影响红小豆蛋白得率，在酶解温度上调至30℃时，得率最高，随着温度继续提高，得率反而降低，原因在于温度过高会减弱纤维素酶活力，使得酶解不彻底，同时在受热情况下，红小豆蛋白会发生分解，降低蛋白质得率[13]。

图6 酶解温度对红小豆蛋白质提取率的影响

3.2.7 纤维素酶用量对红小豆蛋白质提取率的影响

纤维素酶用量对红小豆蛋白提取率的影响见图7。

图7 纤维素酶用量对红小豆蛋白提取率的影响

由图7可知，在酶用量处于一定范围时，红小豆蛋白得率正向相关于酶用量，在酶用量为250 U/g时，可实现最大得率，随着酶用量增加，得率稍见下降。可见，酶用量在250 U/g以下时，酶量少，底物没有充足的酶作用，这时增加酶用量可以使底物与酶解反应充足和完全，随着酶用量继续增加，底物被酶饱和，不会出现明显的酶解变化，且总固形物含量上升，同时纤维素酶扩散作用降低，蛋白质提取率也变化不大[13]。因此，单因素试验确定最佳酶用量为250 U/g。

3.3 正交试验结果

正交试验方案和试验结果见表3，方差分析见表4。

表4 方差分析

通过表3所示R值能够发现，影响红小豆蛋白质得率最大的因素是料液比，其次为超声功率，纤维素酶用量次之，超声时间相对最弱，提取的最优工艺为料液比1∶25（g∶mL），超声功率400 W，纤维素酶用量250 U/g，超声时间30 min。根据最优组合A2B2C3D2，经验证试验结果发现，此工艺下能够实现75.38%的红小豆分离蛋白得率，与正交试验所示各处理得率相比皆偏高，可见所得优化水平具可靠性。

表3 正交试验方案和试验结果

4 结论

超声辅助纤维素酶法技术对红小豆蛋白的提取有显著提高，可以大大增加蛋白质的提取率，在纤维素酶用量250 U/g，料液比1∶25（g∶mL），超声功率400 W，超声时间30 min，实际提取率75.38%。比传统的碱溶酸沉法节省了提取时间，降低了成本，优化了红小豆蛋白提取工艺，为下一步红小豆蛋白质的开发利用奠定了良好的基础，提供了理论指导。