杨复香 刘锦龙 张国庆 周爱明 李磊

（1. 华中农业大学植物科学技术学院 湖北武汉 430070；2. 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 海南海口 571101）

入侵红火蚁（Solenopsis invictaBuren）是一种膜翅目（Hymenoptera），蚁科（Formicidae）的土栖性昆虫，其食性杂，攻击力强，种间竞争优势明显，具有较强的温度适应能力、传播和扩散能力[1-3]，是全球最具危险性的入侵生物之一。红火蚁原分布于南美洲[4]，2003年在中国台湾桃园、台北县发现有红火蚁危害；2004年底，在中国广东吴川首次发现红火蚁入侵[5]；2012年在海口和文昌发现红火蚁入侵[6]；至2018年6月，红火蚁在我国已扩散入侵至11省317县，且扩散传播速度及面积有进一步增大趋势[7]，对我国的农业生产，人类生活、身体健康及入侵地区的生物多样性有重大威胁。

红火蚁是社会性昆虫，其种群具有单蚁后型和多蚁后型2种形态，前者巢穴只有一只可繁殖蚁后，而后者巢穴存在多只可繁殖蚁后[8]。除此之外，2种不同形态的红火蚁种群在蚁巢建巢与分巢方式、蚁巢规模大小、巢穴密度、蚁群结构、种群扩散、蚁后繁殖力、工蚁大小及攻击性强弱和同巢工蚁的遗传相关性等方面均存在一定的差异[9-11]。

红火蚁社会型的产生与基因型有较大关系。Ross等[12]研究发现，蚁群中蚁后的数量与Pgm-3和Gp-9基因的变异有关，而Gp-9表现出比Pgm-3更强的等位基因频率差异，是预测多蚁后型较好的指标[13]；对Gp-9基因进行测序分析发现，其编码一种参与种间化学识别的信息素结合蛋白，这种遗传因素影响蚁后的生殖表型和行为策略，并决定着工蚁是否容纳蚁后。单蚁后型蚁巢工蚁Gp-9基因只携带B等位基因，为纯合子；而多蚁后型蚁巢的工蚁Gp-9处则携带B和b两个等位基因，为杂合子。Gp-9Bb基因型蚁后与Gp-9BB基因型蚁后释放不同的化学信息物质，Gp-9Bb基因型工蚁通过对化学信息素的识别，容纳能够产生相同化学信号的Gp-9Bb基因型蚁后，而排斥Gp-9BB基因型蚁后[14]。

红火蚁社会型鉴定已有较全面的研究，具体鉴定方法有生物学观察法[15]、蛋白质电泳法[16]、探针法[17]、RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism，特异性限制性片段长度多态性分析）法[18]和基于PCR技术的分子手段[19-20]等。其中基于PCR技术的分子鉴定方法简单易行、耗时短且成功率高，仅需提取不同巢穴中工蚁的DNA，在几个小时之内即能完成多个巢穴的鉴定[8]。本研究以采自海南7个不同地方的红火蚁为实验对象，基于PCR技术的分子手段对不同蚁巢的红火蚁Gp-9基因进行扩增并鉴定，以期明确海南不同地区红火蚁蚁巢的社会型，为其防治与监控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用红火蚁工蚁采自海南万宁、琼海、海口、陵水、文昌、屯昌和儋州7个地方的不同蚁巢。采集后的工蚁用95%的酒精保存在‒80℃冰箱中用于后续鉴定。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取将保存在95%酒精中的红火蚁取出，每巢取15头工蚁，用蒸馏水漂洗后，用TIANGEN® TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒进行DNA提取，操作步骤严格按照说明书进行。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA产物纯度，紫外分光光度计（Bio Photometerplus, Eppendorf, 德国）检测其浓度，确保DNA的OD260/OD280和OD260/OD230均在1.8~2.0。检测完后将DNA产物保存于‒20℃。

1.2.2 PCR扩增引物合成参照Valles等[21]和文献[8]，Gp-9B的特异性引物：26BS，5’ CTCGCCGATTCTAACGAAGGA；16BAS，5’ ATGTATACTTTAAAGCATTCCTAATATTTTGTC。Gp-9b的特异性引物：24bS，5’ TGGAGCTGATTATGATGAAGAGAAAATA；25bAS，5’GCTGTTTTTAATTGCATTTCTTATGCAG。Insert5_F1：5’ CGGAGTGCGTACGTGATCT；Insert5_R1_bSpec：5’ CCATGATCGAAAAACCGACT。引物由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。

多重PCR扩增与Gp-9b等位基因扩增反应体系均为50 μL，包括2×PCR Mix 25 μL，4种引物各2 μL，基因组DNA 50~500 ng，用ddH2O补足至50 μL。反应程序为：98℃预变性2 min，35个循环[98℃变性10 s，55℃（Gp-9b等位基因扩增的退火温度为47℃）退火15 s，72℃延伸30 s]，72℃延伸5 min。用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

2 结果与分析

以红火蚁工蚁DNA为模板，利用Gp-9B（26BS，16BAS）和Gp-9b（24bS，25bAS）两对特异性引物进行多重PCR扩增。结果显示，2种社会型的基因型是不同的。多蚁后型蚁巢的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，在423和517 bp处各有一条扩增条带，而单蚁后型蚁巢仅在517 bp处有单一条带。Gp-9b等位基因扩增法用Insert5_ F1和Insert5_R1_bSpec一对特异性引物进行扩增，多蚁后型蚁巢应在259 bp处有单条扩增条带，而单蚁后型蚁巢无条带。

用上述2种方法对在海南7个地区采集的32个蚁巢进行鉴定，多重PCR结果显示，32个蚁巢在500 bp上下各有一条扩增条带（图1）。Gp-9b等位基因扩增结果显示，32个蚁巢均在250 bp左右有单一的扩增条带（图2）。以上2种方法鉴定结果表明，海南7个不同地区采集的32个蚁巢均为多蚁后型蚁巢。

图1 利用多重PCR检测红火蚁的社会型

图2 利用Gp-9b等位基因扩增法检测红火蚁的社会型

3 讨论与结论

不同社会型的红火蚁在蚁巢密度、种群扩散速度等方面的差异与其防治密切相关。研究表明，红火蚁蚁巢密度及分布决定防治方案的制定[22]；蚁巢密度越大，同一剂量茚虫威饵剂对蚁巢防治效果越差[23]；此外，对红火蚁种群扩散速度进行监测能提高防治的有效性[24]。因此，快速鉴定红火蚁社会型对于红火蚁的科学监测及准确防控具有重大指导意义。

Nonacs等[25]认为，红火蚁新入侵一个地区时，栖息地广泛存在且符合单蚁后型繁殖行为策略，而多蚁后型的出现是由于入侵地区适宜筑巢地逐渐饱和。随后的研究表明，Gp-9BB型蚁后只能依靠自身婚飞前储存的能量养育第一代工蚁，而Gp-9Bb型蚁后则可以通过加入已存在的多蚁后型种群共同养育第一代[26]，且不同社会型的工蚁Gp-9基因型的差异导致其识别蚁后及调节蚁后数量的能力不同。在这种简单的遗传控制下，红火蚁表现出基本的社会多型性，因此具有主效作用的Gp-9单基因可以作为红火蚁社会进化中重要复杂行为表达的基础[14]。

利用多重PCR与Gp-9b等位基因扩增法快速鉴定红火蚁社会型的方法已被广泛研究报道并应用，且鉴定结果较为准确可靠[8,11]。Mescher等[27]利用Gp-9b等位基因扩增法发现，南美本土的单蚁后型蚁巢占比高于多蚁后型蚁巢；Kjeldgaard等[28]鉴定了美国德克萨斯州6个红火蚁发生地的73个蚁巢，发现单蚁后与多蚁后型蚁巢数量比接近1∶1。本实验结果表明，海南万宁、琼海、海口、陵水、文昌、屯昌和儋州7个地区的32个蚁巢均为多蚁后型。罗礼智[29]根据蚁巢密度及工蚁大小等推断我国的红火蚁主要为多蚁后型；邵敬国等[11]对广东、广西、福建和湖南4个省（区）120个蚁巢进行社会型鉴定发现，多蚁后型与单蚁后型比例约为4:1。结合前人研究与本实验结果，可以推测在海南省红火蚁中多蚁后型蚁巢可能占主导地位，这与我国的红火蚁以多蚁后型为主的观点相符。但本研究中红火蚁的采样只涉及海南7个地区，并未覆盖全海南，采集的蚁巢数量有限。因此，明确海南地区红火蚁多蚁后型与单蚁后型蚁巢的比例及分布，还需要进一步的大范围采样及鉴定。