连燕萍 赵光辉 吴振强 袁滨 柯丽娜 张志鸿

（1. 漳州市农业科学研究所 福建漳州 363005；2. 福州市农业科学研究所 福建福州 350014）

卵孢小奥德蘑 [Oudemansiella raphanipes(Berk.) Pegler & T.W.K.Young]，也叫卵孢长根菇，商品名为黑皮鸡枞，隶属于真菌界（Fungi）、担子菌门（Basidiomycetes）、伞菌纲 （Agaricomy cetes）、蘑菇目（Agaricales）、膨瑚菌科（Physalacri ceae）、小奥德蘑属（Oudemansiella）[1]。一直以来，学者们对长根菇的分类分歧较大，曾将其命名为长根小奥德蘑（O.radicata）[2]。直到2015年，郝艳佳等[3]通过形态学和分子生物学相结合的方法，对长根菇进行了系统的研究，最终将其定为卵孢小奥德蘑（Oudemansiella raphanipes）。卵孢小奥德蘑在我国大部分地区以及国外都有分布，是一种偏高温结实性的木腐菌，其子实体呈黑褐色，菌肉细嫩爽口，味道极鲜[4]，当前零售价较高，一般在 30~60元/kg。卵孢小奥德蘑子实体中蛋白含量很高，鲜味氨基酸的含量特别高[5]，子实体和菌丝发酵液中含有多种药用成分，其中长根菇素有降压功效，长根菇多糖有抗氧化和消炎护肝等作用，具有极高的药用价值，是一种极具应用价值的珍稀食用菌[6]。目前卵孢小奥德蘑在我国多个省市地区均有种植。由于卵孢小奥德蘑在我国的栽培历史短，从20世纪80年代初期至今仅有30年左右的时间，研究重点主要在菌丝培养、栽培技术和生物学特性等方面[7-8]，在卵孢小奥德蘑菌株的亲缘关系分析鉴定方面的报道极少，采用拮抗试验和ISSR-PCR标记分析相结合的方法对卵孢小奥德蘑菌株进行分析鉴定更为少见。随着卵孢小奥德蘑种植范围的扩大、种植面积的增大，在生产及试验过程中菌种混杂、种源不清楚、同名异株、同株异名的问题渐渐出现，而且品种退化较严重，优质菌种利用率低，严重制约了产业的发展。因此，本研究收集了15个来自国内不同地区的卵孢小奥德蘑菌株，通过拮抗试验和ISSR-PCR标记分析对收集到的菌株进行分类鉴定及遗传多样性分析，以期明确卵孢小奥德蘑菌株的亲缘关系，为卵孢小奥德蘑种质资源保护、良种选育、杂交育种提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材供试材料为15个卵孢小奥德蘑菌株，具体信息如下（表1）。

表1 供试的卵孢小奥德蘑菌株

1.1.2 试剂及引物Taq DNA聚合酶、dNTP、引物均购自上海生物工程技术服务有限公司，其他试剂均为进口或国产分析纯试剂。

1.1.3 培养基PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，水1 000 mL，121 ℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 拮抗试验将供试菌株进行扩繁培养，取菌龄相同的菌株进行试验，按品字形将3个不同菌株接种到同一平板中[9]，置于25℃恒温培养箱培养，待菌丝长满后，观察不同菌株间的拮抗反应情况。试验设置3个重复。

1.2.2 供试菌株DNA提取基因组DNA采用试剂盒法进行提取。

1.2.3ISSR-PCR分析ISSR引物筛选：选取能够扩增出稳定特异条带的20条引物，对供试菌株进行扩增（表2）。

表2 供试菌株鉴定所用ISSR引物

ISSR-PCR扩增体系：在25 μL反应体系中，引物1 μL、dNTPs 2 μL、Taq酶0.3 μL、Buffer缓冲液2.5 μL、模板DNA1 μL、ddH2O 18.2 μL。

ISSR-PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，44~52 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸 10 min。

ISSR-PCR扩增产物检测：1.0%琼脂糖凝胶（含0.5 μg/mL GoldviewTMDNA染料）电泳检测。

1.2.4 数据分析供试菌株的拮抗试验结果以NY/T 1845—2010为鉴定方法进行判断。

ISSR分析是通过对扩增产物的分析，将出现的稳定性条带记为1，无条带记为0，得到矩阵表，通过公式算出多态位点百分率P[10]。通过NTSYS-pc 2.0软件进行聚类分析，得出遗传聚类分析图。

2 结果与分析

2.1 供试菌株的拮抗反应分析

拮抗反应分析是初步鉴定菌株差异的方法。若菌丝长满后，菌株之间的菌丝无明显差异、菌落交界处能融合，可初步鉴定为无拮抗反应；若菌丝长满后，菌丝接触区出现隔离拮抗线、沟壑状、菌丝隆起或者产生色素带等，则初步鉴定为有拮抗反应。如图1所示，菌株2与菌株5、11之间的拮抗反应明显，表现为沟壑状，菌株5与菌株11的拮抗反应表现为不明显的拮抗线，菌株5、6、8之间没有拮抗反应。供试的15个菌株之间的拮抗反应结果具有一定的差异，拮抗反应结果见表3。从表3可以看出，有44组产生拮抗反应，61组没有产生拮抗反应，其中菌株1与菌株2、3、14有明显的拮抗线，菌株2、3、14 与其他菌株之间的拮抗线也非常明显，均呈现为沟壑状拮抗线。其他菌株之间的拮抗反应不明显，大部分菌株在平板上没有拮抗反应。

图1 供试菌株拮抗图

表3 供试菌株间的拮抗反应情况

2.2 供试菌株的遗传相似系数分析

遗传相似系数通常用来度量群体或个体间的相似程度。样本的遗传关系越近，遗传相似系数越大，反之相似系数越小[11]。试验结果表明，15个供试菌株的遗传相似系数在0.420~0.885，平均值为0.628；其中菌株2和菌株3遗传相似系数最大，表明这2个菌株在这15个引进菌株群体中的亲缘关系最近；而菌株6与菌株14遗传相似系数最小，表明这2个菌株的亲缘最远。菌株2、3，菌株4、9，菌株7、8，菌株9、13，菌株11、12，菌株13、15之间的遗传相似系数均≥0.75，远大于平均值，表明这几个菌株间的亲缘关系相对较近；从遗传相似矩阵数值（表4）分布可以看出，遗传相似系数≥0.8占比2.9%，遗传相似系数≤0.5占比3.8%，遗传相似系数为0.7~0.79、0.60~0.69、0.50~0.59占比分别为19.1%、41%、33.3%，表明这15个菌株间具有一定的遗传多样性和较高的遗传丰富度。

表4 相似性矩阵表

2.3 供试菌株的ISSR多态性分析

试验选取能够扩增出稳定特异条带的20条引物对卵孢小奥德蘑菌株进行ISSR扩增，分别为807、811、815、834、840、841、842、844、853、854、864、876、884、885、886、887、888、889、895、899。这20条引物对卵孢小奥德蘑菌株均能扩增出稳定条带，多态性条带在11~24条，共扩增出357条稳定性条带，其中多态性条带达329条，多态性比率为92.16%。图2为引物864、884、899扩增供试菌株的指纹图谱。

图2 引物864、884、899对卵孢小奥德蘑菌株扩增的ISSR指纹图谱

2.4 供试菌株DNA扩增图谱聚类分析

卵孢小奥德蘑菌株DNA扩增图谱聚类见图3。从图3可以看出，15个卵孢小奥德蘑菌株在相似性系数约为0.72水平时，可聚成7个类群：第1个类群为菌株1（山鸡枞）；第2个类群为菌株4（天华鸡枞）、9（南昌鸡枞）、13（南靖鸡枞2）、15（武汉鸡枞2）；第3个类群为菌株5（建木鸡枞）、7（Q002）、8（南靖鸡枞1）；第4个类群为菌株10（S鸡枞）、11（中枞）、12（HP）；第5个类群为菌株6（所鸡枞）；第6个类群为菌株2（分鸡枞）、3（四川鸡枞）；第7个类群为菌株14（武汉鸡枞1）。

图3 卵孢小奥德蘑菌株ISSR多态性的聚类图

供试菌株之间的遗传相似系数在0.56~1.00，说明这15个菌株的遗传相似性较高，基因来源较窄，其中菌株2、3的相似系数最高，为0.89，说明这2个菌株的亲缘关系比较近。菌株9、13的相似系数达0.81，说明这2个菌株的亲缘关系较近，但有一定的差异性，同时这2个菌株与菌株4的相似系数约为0.785，与同一类群的菌株15的相似系数约为0.725。第3类群的菌株7、8相似系数为0.77，与同类群的菌株5的相似系数约为0.735。第4类群的菌株10、11的相似系数约为0.79，与同一类群的菌株12相似系数约为0.74。菌株2、3和菌株14的相似系数约为0.61。第6类群的菌株2、3与第7类群的菌株14组成分支，与其他类群组成的分支的相似系数最小仅为0.56。

3 讨论

人们最早通过菌落生长特征、子实体形态特征的不同来鉴别不同食用菌菌株，但由于所需周期长、易受环境和主观因素的影响，难以鉴别形态差异不明显的菌株[12-13]。拮抗试验是在生理水平上的体细胞不亲和性试验[14-15]，具有简单、快速、直观等特点，食用菌普遍存在体细胞不亲和性现象，因此拮抗试验常用来初步鉴定不同菌株间的遗传差异[16-17]。研究表明，拮抗试验中对峙培养的菌株在菌落交界处的菌丝可分为隔离型、隆起型、色线型、沟壑型4种[18]。在本试验中，通过拮抗试验，供试的15个菌株中，菌株2、3、14与其他菌株之间有明显的拮抗反应，均呈现为沟壑型，初步说明菌株2、3、14与其他菌株的亲缘关系比较远。其他菌株之间的拮抗反应不明显，甚至没有拮抗线，初步说明这些菌株的亲缘关系比较近。

ISSR技术（Inter Simple Sequence Repeats）因具有稳定性强、多态性好、严谨度高、重复性好、高效快速等特点，目前被广泛应用于食用菌种质资源鉴定及遗传多样性分析等方面[19]。张介驰等[13]利用ISSR分子标记，快速准确地将黑木耳生产菌株有效地区分开。宋小亚等[20]通过ISSR标记对黑木耳单核体菌株进行遗传分析，发现各个担孢子充分杂交或与某一亲本相类似，从而反映出不同单核体菌株之间的遗传变异。贾定洪等[21]利用拮抗与ISSR方法对香菇菌株进行鉴定，结果表明，ISSR技术能够清晰区分2个菌株并量化出2个菌株间的遗传差异。冯伟林等[22]利用ISSR技术筛选的11个引物对12个杏鲍菇菌株基因组进行PCR扩增并构建指纹图谱，发现ISSR技术能够将杏鲍菇菌株聚为3个群，清晰地揭示出了12个杏鲍菇菌株间的遗传关系。本试验利用筛选到的20条引物对15个卵孢小奥德蘑菌株进行PCR扩增，ISSR分析结果显示，DNA指纹图谱多态性较高。结合相似性系数矩阵表，在相似性系数约为0.72水平时，将供试菌株分成7个类群，表明这15个卵孢小奥德蘑菌株具有一定的遗传多样性与差异。

前人研究显示，双孢蘑菇[11]、香菇[21]、杏鲍菇[22]、白灵菇[23]、灵芝[24]、真姬菇[25]、姬松茸[26]等拮抗反应结果与ISSR分析或其他分子鉴定方法的分类结果相吻合，但也有少部分拮抗试验结果与聚类分析存在差异。杨和川等[27]研究发现，拮抗试验不能完全准确鉴定金针菇菌株的遗传差异。赵淑英等[28]发现，金针菇菌株的拮抗试验结果与聚类分析结果有一定的差异。袁滨等[29]利用拮抗反应结合ISSR-PCR鉴定11个灰树花菌株，拮抗反应与ISSR分析结果存在差异。本研究通过拮抗反应试验与ISSR分析鉴定15个卵孢小奥德蘑菌株，菌株2、3和菌株14与其他菌株之间的拮抗反应强烈，菌株2、3和菌株14在聚类图中分别单独聚成一类，这表明，拮抗反应与ISSR分析鉴定具有一定的一致性。同样条件下，菌株1、6也分别单独聚成一类，且与其他菌株之间的相似系数均比较低，但拮抗试验表明，菌株1、6与大部分菌株均没有明显拮抗现象。拮抗结果中有44组产生拮抗反应，61组没有产生拮抗反应，没有拮抗反应的组别较多，但是在聚类分析中菌株之间的相似系数均比较低，这说明拮抗结果与ISSR分析结果存在一定的差异，可能原因是拮抗试验与菌种继代培养次数或者培养基有一定关系，这也说明拮抗试验只能为初步鉴定菌株提供参考，最终应结合分子标记技术等多种鉴定方法进行综合分析评价。本试验结果表明，供试的15个菌株的来源地与聚类分析结果相关性不明显，出现不同地区来源的菌株聚为一类，说明这15个菌株的遗传基础相对集中，也可能在栽培与品种选育的过程中，出现了不同地区之间相互引种或菌株分离、亲本杂交的现象。

本研究采用拮抗试验与ISSR分子标记相结合的方法来分析15个卵孢小奥德蘑菌株的遗传多样性，结果表明，15个菌株具有一定的遗传差异与多样性，其中菌株2、3关系较近且聚成一类，菌株1、6、14均单独聚成一类，说明与其他菌株有较大差异，可作为品种选育的亲本菌株。前人研究结果表明，利用多种分子标记分析比单独使用一种分子标记鉴定的结果更准确[30]。因此，后续可以考虑结合多种分子标记技术进行验证，为卵孢小奥德蘑菌株新品种选育和杂交育种提供依据。