张秋怡，石瑞丽，齐瑞芳，吕 军，时静华，王立军，马宝慧

(1.包头医学院2020级研究生，内蒙古 包头 014040；2.包头医学院基础医学与法医学院)

氟存在于自然界的每个角落，是人体不可或缺的微量元素之一，摄取适量的氟化物有助于龋齿的预防及骨骼的发育，但过多的摄入会对机体造成严重的损伤[1-2]。相关研究结果显示，过量摄取氟化物会对非骨性组织如心、脑、肾、肝和睾丸等造成不可逆性的损伤[3-4]。相关文献表明，长期氟暴露与心脏病的发病率有关，主要包括动脉粥样硬化、心肌梗死和高血压等[5]。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase-1)是调控细胞焦亡及炎症方面至关重要的蛋白。当外来刺激物致炎症发生时，炎症小体NLRP3被激活，随之激活其下游的caspase-1，被激活的caspase-1继续激活消皮素家族成员，使其N端发生剪切致细胞膜完整性遭到破坏，与此同时，caspase-1还会激活细胞内的炎性因子，最后致细胞内的炎性因子被释放，发生细胞程序性死亡。Li等[6]实验发现，NaF(25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)可以诱导C57BL/6J雄性小鼠小肠发生炎症反应致细胞焦亡。然而长期氟暴露是否通过依赖caspase-1所引发的炎症反应而诱导心肌细胞发生损伤，截至目前尚未有相关报道。我们课题组先前的实验结果表明，随着氟化钠浓度的增加，H9c2心肌细胞caspase-1蛋白和mRNA表达量随之上升，且呈剂量依赖性[7]。因此，本研究将Wistar大鼠作为研究对象，建立体内长期氟暴露模型，研究不同浓度NaF对大鼠心肌caspase-1和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达的影响。

1 材料与方法

1.1材料 40只体质量为90～110 g，清洁级雄性健康Wistar大鼠，购自北京芳元缘养殖场[SCXK(京)2014-0012]。将实验动物喂养在内蒙古科技大学包头医学院动物中心，室温保持(25±1) ℃，相对湿度(55±5) %,光照周期(明∶暗=12 h∶12 h)，动物自由饮去离子水，自由进食常规饲料，适应性喂养一周。

1.2方法

1.2.1动物分组及给药 适应性喂养结束后，40只大鼠随机分为4组，即空白对照组，低剂量染氟组(50 mg/L)，中剂量染氟组(100 mg/L)和高剂量染氟组(200 mg/L)，10只/组。所有大鼠均喂食常规饲料，空白对照组饮用去离子水，其他三组分别饮用不同浓度的含氟去离子水。所有大鼠自由进食及饮水，连续喂养7个月。

1.2.2慢性氟中毒模型制备 按照如上分组的方法7个月后，观察不同染氟组大鼠氟斑牙情况。观察指标主要包括牙齿光泽度、斑块条纹的形成、缺损情况等。

1.2.3观察指标

1.2.3.1心肌取材 饲养7个月后，用10 %水合氯醛麻醉大鼠，采用滴灌法为大鼠灌注0.9 %生理盐水及4 %多聚甲醛溶液进行心脏固定，滴灌结束后迅速在冰冻台上取出心脏；将取出的心脏继续固定在4 %多聚甲醛溶液中，用于后续制作石蜡切片。

1.2.3.2免疫组织化学染色 将所得石蜡切片通过二甲苯溶液进行脱蜡，不同梯度的无水乙醇进行复水处理，处理完成后加入3 %过氧化氢(H2O2)溶液进行内源性过氧化物酶反应15 min，抗原修复10 min，自然冷却后，PBS清洗3次，10 min/次，5 % BSA溶液孵育，去除多余孵育液，加一抗，4 ℃过夜。次日，加二抗37 ℃孵育1 h，PBS清洗3次，10 min/次，DAB显色，蒸馏水清洗苏木精复染，自来水蓝化，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在光学显微镜下观察结果并拍照，采用Image J软件进行统计并分析。

2 结果

2.1慢性氟中毒模型制备情况 NaF染毒7个月，空白对照组大鼠牙齿有光泽，呈淡黄色且颜色均一，染毒组大鼠由于染氟浓度具有差异，从而展现不同程度的氟斑牙，轻者牙釉质表面失去光泽，形成白垩状斑块略粗糙，重者牙釉质表面完全失去光泽，全牙呈现黄褐色斑块，颜色不一，粗糙且部分牙齿有缺损。随着氟浓度的升高，氟斑牙程度逐渐加重，呈剂量依赖性，表明慢性氟中毒模型造模成功。

2.2免疫组织化学染色检测氟暴露大鼠心肌TNF-α表达情况 结果显示，与空白对照组相比，氟暴露组心肌细胞TNF-α表达明显加强，差异具有统计学意义(F=24.316，P<0.001)。见图1。

图1 长期氟暴露对大鼠心肌TNF-α表达的影响注：左图免疫组织化学染色图像，A为空白对照组，B为50 mg/L组，C为100 mg/L组，D为200 mg/L组；右图阳性细胞统计结果，与对照组比较，*为P<0.05

2.3免疫组织化学染色检测氟暴露大鼠心肌caspase-1表达情况 结果显示，空白对照组大鼠心肌caspase-1表达较少，心肌细胞着色程度较浅；与对照组相比，氟暴露组心肌细胞着色相对较深，且随着氟浓度的增加颜色逐渐加深，阳性表达加强(F=13.303，P<0.001)。见图2。

图2 长期氟暴露对大鼠心肌caspase-1表达的影响注：左图免疫组织化学染色图像，A为空白对照组，B为50 mg/L组，C为100 mg/L组，D为200 mg/L组；右图阳性细胞统计结果，与对照组比较，*为P<0.05

3 讨论

氟主要以氟化物的形式存在于自然界中。众所周知，低剂量的氟有助于牙齿和骨的生长，但摄入过量则会导致机体出现若干健康问题。吴云飞等[8]通过实验证实，长期氟暴露可导致QT间期缩短，诱导心肌发生细胞凋亡。Yan等[9]实验表明，30 mg/L和90 mg/L NaF处理大鼠6个月后，对照组心肌细胞肌丝排列整齐，Z、M线清晰有条理，染色均匀；30 mg/L组心肌细胞肌丝排列较疏松，整体差异不显著；90 mg/L组心肌细胞肌丝排列紊乱，Z、M线断裂，核形态受损，细胞破裂。我们前期的实验也发现了氟对心肌结构的损伤，与上述研究结果一致。但是，长期氟暴露对心肌损伤的机制尚不明确。

活性氧在维持机体内环境稳态和细胞信号传导中具有重要作用。在毒性、高温和紫外线下等情况下，活性氧的生成显著增加，对细胞结构造成严重损害，从而引发氧化损伤。本课题组前期研究显示，氟染毒可诱导H9c2心肌细胞活性氧过量产生，且过量氟可导致大鼠处于氧化应激状态[10]。活性氧生成与激活炎症通路有关[11]。TNF-α是炎症反应中一种重要的细胞因子，可调节心肌细胞损伤及重塑过程。心肌损伤可释放TNF-α，TNF-α也可刺激活性氧释放。TNF-α相关研究证实，冠心病患者通过介入治疗后血清中caspase-1、白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、TNF-α表达水平显著下降[12]。VarlB等[5]的实验发现，NaF致Wistar大鼠心肌核转录因子(Nuclear factor-κB,NF-κB)、TNF-α及IL-1β表达水平显著增加。Panneerselvam等[13]发现，氟处理使大鼠心肌磷酸化核转录因子p65(Ser536)[Phosphorylated-nuclear factor-κB p65(Ser536),pNF-κB p65(Ser536)]、磷酸化核转录因子抑制蛋白α/β(Ser176/180) [Phosphorylated-nuclear factor-κB-inducing kinase α/β(Ser176/180),pIκKα/β(Ser176/180)]及其下游TNF-α表达水平显著升高。这与我们的研究结果一致，表明长期摄入NaF会诱导大鼠心肌细胞出现炎症反应。炎症反应及氧化应激可直接损伤心肌细胞，使心脏功能受损。

Caspase-1参与炎症反应和程序性细胞死亡过程，常以未激活的酶原状态存在于胞质中，炎性体刺激后，未激活的酶原变成激活状态，促进炎症因子IL-1β的转化和释放。心肌组织缺氧可引起caspase-1异常表达而使心肌细胞凋亡[14]。Caspase-1表达上调也可引起细胞焦亡。大量研究报道，细胞焦亡参与了众多心血管疾病的发生，包括心肌缺血再灌注损伤、糖尿病心肌病、心肌肥厚等[15-17]。Shi等[15]的研究中，C57BL/6J小鼠心肌缺血再灌注损伤可见NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)和caspase-1表达显著上调，且炎症因子白介素18(Interleukin-18,IL-18)、IL-1β、TNF-α的表达也显著上升，这表明小鼠心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞发生了焦亡。吕展等[18]实验发现，3’,4’-二羟基黄酮醇通过抑制caspase-1和IL-1β的激活,从而改善血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠心肌肥厚和纤维化。相关研究表明，细胞焦亡所释放的炎症因子IL-18是NLRP3激活的下游产物之一，它有助于TNF-α的产生，同时TNF-α可以触发NF-κB通路，进而导致NLRP3和IL-18的转录，这种交叉作用再次加重了心肌组织的炎症损伤[19]。本研究结果表明，中长期氟暴露后大鼠心肌caspase-1和TNF-α表达显著增加，推测这可能是由于氟诱导大鼠心肌细胞发生了细胞焦亡。

综上所述，长期氟暴露不仅可以改变大鼠心肌细胞中caspase-1和TNF-α的表达水平，且与染氟浓度有关，推测可能与依赖caspase-1的经典细胞焦亡途径有关，但还需进行更深入的研究，以进一步明确长期氟暴露与心肌细胞损伤的关系，以期为地氟病的防治工作贡献微薄力量。