徐喆，金昱彤，赵泽宇，王莹，龚博炀，周会芳，边育红

（天津中医药大学中西医结合学院，天津 301617）

溃疡性结肠炎（UC）是一种病因复杂、难以治愈的慢性炎性肠病，以黏液脓血便、腹泻、腹痛及里急后重为主要临床表现，其复发率高、极易癌变被世界卫生组织列为难治病之一[1-3]。UC严重影响患者的代谢功能，降低患者的生活质量，并给社会带来了沉重的卫生经济负担。当前UC的发病机制尚不明确，现有研究认为其发生主要与遗传、肠道微环境、免疫反应、细胞凋亡及感染等因素有关；临床上对UC的治疗以氨基水杨酸类药物、肾上腺皮质激素类药物与免疫抑制剂3类药物为主，但是存在毒副作用大、起效慢等问题[4-5]。

中医药在UC的防治中发挥了十分重要的作用，针对UC病因、病机、分期进行辨证论治，从而改善临床症状、促进黏膜愈合、预防及治疗并发症，取得了良好的疗效[6-8]。研究表明，多种中药复方已被证实具有良好的治疗UC效果，并获得国家专利，如结肠复康颗粒、结肠炎奇效颗粒、肠清口服液等[9-10]。网络药理学是虚拟筛选潜在活性物质、作用靶点和通路，对药物作用的机制和物质基础进行预测的一种现代化研究手段[11-13]。研究通过挖掘国家专利数据库中治疗UC的中药复方数据，分析其用药规律和配伍特点，选取高频核心药物，运用网络药理学筛选治疗UC的核心作用靶点，构建作用靶点蛋白互作关系、中药-成分-治疗靶点-疾病网络，初步探索和阐述中药复方专利核心药物治疗UC的药理学机制，为临床治疗UC及中药新药研发提供理论参考，整体研究思路如图1所示。

图1 国家专利中药复方高频核心药物治疗UC的作用机制研究思路Fig.1 Research thinking of action mechanism of national patent Chinese medicinal compound high-frequency core drugs in the treatment of UC

1 材料与方法

1.1 复方数据来源 登录“国家知识产权局-中国专利公布公告”网站（http：//epub.sipo.gov.cn/），进入“高级查询”页面，在高级查询页面中专利类型栏同时勾选“发明公布”与“发明授权”，将“溃疡性结肠炎AND中药”作为“名称”项目进行检索，对检索结果进行合并、筛选后得到最终数据。检索时间范围为建库至2021年12月10日。

1.2 复方纳入与数据标准化 复方纳入：纳入国家专利数据库中治疗UC的全部中药复方专利及含中药提取物专利；中药药物组成相同但用量不同的专利可重复录入，中药药物组成及用量相同的专利仅录入1次。排除外用灌肠复方和非中医药医疗类（包括饮品、食品、保健品）专利。

数据规范及处理：依据2020年版《中国药典》《中华本草》的药物名称进行对录入的中药名称进行规范化处理；按照《中药学》规范中药复方的药物功效类别。

1.3 数据关联规则与聚类分析 利用IBM SPSS Modeler18.0软件，基于Apriori算法对已纳入的中药复方进行关联规则分析，设置同时满足支持度≥5.0、置信度≥0.5和提升度≥2的药对为治疗UC的核心药物。利用IBM SPSS Statistics 24软件中的组间联接聚类算法，对高频药物进行聚类分析。

1.4 中药复方专利高频核心药物化学成分与作用靶点挖掘 通过中药系统药理学分析平台数据库[14]（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）挖掘高频核心药物的化学成分，设置化合物生物口服利用度（OB）≥30%、类药性指数（BL）≥0.18，筛选高频核心药物的活性成分和蛋白靶点。此外，通过查阅文献整理已报道的高频核心药物的化学成分，通过PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、Swiss ADME数据库[15]（http：//www.swissadme.ch/）和Swiss Target Prediction数据库[16]（http：//www.swisstargetprediction.ch/）预测各主要化合物作用的靶点蛋白，收集probability＞10%的靶点。使用Uniport数据库[17]（https：//www.uniprot.org/）对蛋白进行名称规范转化操作，去重后即得高频核心药物的对应靶点基因。

1.5 溃疡性结肠炎潜在靶点获取 以“ulcerative colitis”为关键词分别在GeneCards数据库[18]（https：//www.Genecards.org/）、人类孟德尔遗传数据库（OMIM，http：//www.omim.org/）和Drugbank数据库[19]（https：//go.drugbank.com/）进行检索，获取UC相关靶点。

1.6 蛋白质相互作用网络的构建及核心靶点筛选 将高频核心药物作用靶点和UC潜在靶点进行比对，筛选重复靶点，得到中药复方专利高频核心药物治疗UC的作用靶点，并导入StringVersion11.5平台[20]（https：//string-db.org/），选择物种为“Homosapiens”，构建蛋白相互作用（PPI）网络。选取分值＞0.7分的高置信度区间，并根据自由度值≥2倍中位数的靶点构建PPI网络，筛选核心靶点。

1.7 高频核心药物-成分-治疗靶点-疾病网络构建 将高频核心药物、化合物成分、治疗靶点信息、疾病导入Cytoscape 3.8.0软件[21]绘制中药-成分-成分-治疗靶点-疾病网络图。

1.8 京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路和基因本体（GO）功能富集分析 为进一步研究中药复方专利高频核心药物治疗UC的作用情况，分别使用KOBAS 3.0在线基因富集网站[22]（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/）和Metascape平台[23]（http：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）对核心靶点进行KEGG信号通路和GO功能富集分析，结果以P值升序排列。

2 结果

2.1 专利检索统计与分析 通过检索国家专利数据库，共获得专利项目220项，纳入符合标准的共175项。175项专利涉及药物576味，纳入中药复方中最多药味数为40，最少的药味数为3，用药频次总计2 174次。其中使用频率≥10次的药物共49味，占总使用频次的52.94%，见表1。使用频次及频率排在前10位的药物为甘草、黄连、白术、黄芪、白及、白芍、党参、白头翁、地榆、木香。对频次≥10次的药物进行功效类别分析，发现各中药类别使用频率排名前3位的为：补虚药、清热药和止血药，见开放科学（资源服务）标识码（OSID）。疗效上多可补气健脾、清热解毒、止血、理气，该用药特点与中医理论对“久痢”的基本病机“脾气虚弱、湿热蕴肠”相符。

表1 175项治疗溃疡性结肠炎中药复方专利高频药物（≥10次）Tab.1 The 175 traditional Chinese medicine compound patent high-frequency drugs for the treatment of ulcerative colitis(≥10 times)

2.2 关联规则与聚类分析 将49味高频药物导入IBM SPSS Modeler 18.0软件中，基于Apriori算法对高频药物进行关联规则分析，设定最低条件支持度百分比≥7，最小规则置信度百分比≥70，提升度＞1，得出中药专利复方治疗UC在组方配伍时同时出现且频率较高的药对、药组。关联规则结果以“后项→前项”展示，按支持度由高到低排序。

1）设定最大前项数为1，进行中药专利复方治疗UC药物关联二阶分析，详见开放科学（资源服务）标识码（OSID）。结果显示二阶关联规则中支持度最高的为甘草-陈皮。2）设定最大前项数为2，进行中药专利复方治疗UC药物关联三阶分析，详见开放科学（资源服务）标识码（OSID）。结果显示三阶关联规则中支持度最高的为黄连-木香-甘草。3）根据数据挖掘结果，绘制高频药物关联规则web可视化布局图。通过线条粗细来表示药物配伍关系的强弱，线条越粗，药物之间的配伍关系越强，结果如图2所示。4）运用IBM SPSS Statistics 24软件中的组间联接聚类算法，对上述49味高频药物进行聚类分析，结果见开放科学（资源服务）标识码（OSID）。

图2 高频药物关联规则web可视化布局图Fig.2 Web visual layout diagram of high-frequency drug association rules

2.3 高频核心药物作用化合物及靶点 根据表1，选取频次排名前6位中药（甘草、黄连、白术、黄芪、白及、白芍）为治疗UC的高频核心药物，该核心药物与“2.2关联规则与聚类分析”中所得结果基本相同。综合文献报道以及各数据库检索筛选收集所得的结果，高频核心药物的作用化合物及对应靶点蛋白数目见开放科学（资源服务）标识码（OSID）。其中甘草89种，黄连13种，白术4种，黄芪18种，白及8种，白芍8种，去除重复后总计获得129个化合物，涉及相关作用靶点931个。

2.4 UC疾病潜在靶点 经GeneCards数据库检索，得到UC相关靶点4 837个，按相关性得分≥10选取后得到186个潜在靶点。在OMIM和Drugbank数据库中分别找到UC相关靶点182和78个。三者相加即为UC潜在靶点，去除重复基因，共得到376个疾病靶点。

2.5 蛋白质相互作用网络的构建及核心靶点筛选 将高频核心药物化学成分的931个靶点与UC潜在靶点取交集，查找治疗靶点共111个，见开放科学（资源服务）标识码（OSID）。将111个蛋白导入STRING平台进行蛋白互作网络可视化，见开放科学（资源服务）标识码（OSID）。根据自由度筛选得到23个核心作用靶点，见开放科学（资源服务）标识码（OSID）。

2.6 构建中药复方专利高频核心药物-成分-治疗靶点-疾病网络 将中药复方专利高频核心药物6个单味中药、涉及的129个化合物成分、111个治疗靶点和1个UC疾病信息导入Cytoscape 3.8.0软件绘制中药-成分、成分-疾病靶点网络图。如图3所示，网络图共涉及241个节点和1 400条边。网络模型中节点的面积越大代表该节点在网络中的连接度越高。其中八边形节点表示单味高频核心药物，六边形节点表示化合物成分，菱形节点表示核心靶点，三角形代表溃疡性结肠炎疾病。

图3 高频核心药物-成分-治疗靶点-疾病网络图Fig.3 Network diagram of high-frequency core drugs-components-treatment targets-diseases

2.7 KEGG通路和GO富集分析 将23个核心作用靶点导入KOBAS 3.0网站，通过“KEGG通路富集分析”模块，得到KEGG通路总计164条。排名靠前的通路主要有糖尿病并发症中的晚期糖基化产物（AGE）-晚期糖基化终末产物受体（RAGE）信号通路、白介素（IL）-17信号通路、炎症性肠病（IBD）信号通路、t细胞受体信号通路、辅助性T细胞17（Th17）细胞分化信号通路等，按P值对排名前20名的通路途径进行展示，绘制富集分析气泡图，见图4。将前20条关键通路和23个核心靶点信息导入Cytoscape软件绘制关键通路-靶点信息网络图。如图5所示，网络图共涉及42个节点和236条边。网络模型中节点的面积越大代表该节点在网络中的连接度越高。其中正方形表示关键通路，圆形表示核心靶点。

图4 高频核心药物主要靶标基因调控的相关通路富集分析气泡图Fig.4 Bubble diagram for enrichment analysis of relevant pathways for regulation of main target genes of high-frequency core drugs

图5 高频核心药物治疗UC关键通路-核心靶点网络图Fig.5 Network diagram of key pathways-core targets of high-frequency core drugs in the treatment of UC

同时将这23个核心作用靶点蛋白导入Metascape平台进行GO生物过程、细胞组分以及分子功能富集分析，总计获得716条生物过程条目，13条细胞组分条目，31条分子功能条目。根据P值进行排序，绘制富集分析气泡图，见开放科学（资源服务）标识码（OSID）。

3 讨论

根据UC的临床表现和病变特点，归属于中医“泄泻”“久痢”“滞下”等范畴，发病基础为素体脾气虚弱，感受外邪、饮食不节（洁）、情志失调为发病诱因，辨证分型为：大肠湿热、热毒炽盛、脾虚湿蕴证等，治疗总以清热化湿、健脾益气为主[3]。目前治疗UC多采用分期治疗，活动期主要以清热化湿、调气和血为主，临床多运用黄连、黄柏、白及、白芍等药物，缓解期主要以健脾益气为主，临床多运用党参、黄芪、白术、甘草等药物。

研究共纳入175项国家专利数据库中治疗UC的中药复方专利，包含576味药物，通过药物频次分析可知治疗UC的高频药物共有49味，其中使用频率排在前6位的中药分别是：甘草、黄连、白术、黄芪、白及、白芍。甘草具有补益脾气、清热解毒的功效，发挥抗菌、抗炎、抗溃疡等多种药理作用[24]。黄连具有清热燥湿、泻火解毒的功效，发挥抗菌、抗病毒、抗溃疡等多种药理作用，现代研究表明：黄连素、黄连提取物小檗碱、黄连总生物碱、黄连水煎液等对UC具有较好的保护作用[25-30]。白术具有健脾益气、燥湿利水的功效，发挥抗炎、调节消化系统等多种药理作用[31]。黄芪具有补气升阳、托毒排脓、敛疮生肌的功效，发挥抗肿瘤、免疫调节、抗纤维化等多种药理作用[32]。白及具有收敛止血、消肿生肌的功效，发挥抗菌、抗炎、促进创伤愈合等多种药理作用[33]。白芍具有养血调经、敛阴止汗的功效，发挥抗炎、抗氧化等多种药理作用[34]。6味高频核心药物与临床治疗UC药物一致，黄连、白及、白芍以清热化湿、调气和血为主，黄芪、白术、甘草以健脾益气为主。

根据高频药物类别分析，结果显示占据前3类的是补虚药、清热药和止血药，这与高频核心药物前6位分布一致。在治疗UC的专利复方中，常以补虚药为主，清热药和止血药为辅。根据高频药物聚类分析共得出7个聚类组合，聚3类：黄柏、秦皮、白头翁、黄连、木香、党参、白术、茯苓、白芍、陈皮、防风等，药物组合以清热解毒药为主，补虚药、理气药、止血药为辅。从这类药物组合来看，可视为白头翁汤、痛泻要方与参苓白术散化裁而来，其功擅清热解毒、活血止痢、健脾益气、化湿止泻，适用于UC热毒炽盛、肝郁脾虚和脾虚湿阻者。由此得出治疗UC的专利复方尤注重健脾益气、清热解毒、化湿止泻。

选取6味高频核心药物，通过在线数据库共筛选出129个化合物，涉及相关作用靶点931个，挖掘出治疗靶点111个、核心靶点23个，构建了治疗靶点蛋白互作关系网络及高频核心药物-成分-治疗靶点-疾病网络图，将核心靶点导入KOBAS 3.0网站和Metascape平台进行分析，得到KEGG通路共164条，GO生物过程716条，GO细胞组分13条，GO分子功能31条。

分析蛋白互作关系网络可知，高频核心药物治疗UC的核心靶点包括信号转导和转录激活因子3（SATA3）、肿瘤坏死因子（TNF）、IL-6、IL-1β、丝氨酸/苏氨酸激酶 1（AKT1）、JUN、肿瘤蛋白 P53（TP53）等。STAT3介导细胞对生长因子的反应的信号转导和转录的激活，与IL-6、JAK2共同调控免疫与炎症反应，研究表明：中药调控IL-6/JAK2/STAT3信号通路，抑制炎症介质与细胞因子的活化，防治UC具有良好疗效[35-36]。TNF-α是炎症性肠病病理进程中的关键细胞因子，可表达黏附分子、凝血因子，启动细胞毒性和凋亡等过程，中药可显著降低TNF-α水平，缓解UC的发生发展[37-38]。IL-1β与TNF-α同为促炎因子，主要由单核-巨噬细胞所产生，可促进B细胞分化和分泌抗体，进一步刺激T细胞分化IL-2和干扰素γ的产生，调节机体免疫功能，多种中药复方可显著降低IL-1β水平，促进黏膜组织修复[39-40]。TP53是与肿瘤相关的一种抑癌基因，其编码产生的p53蛋白与细胞周期的调控、细胞凋亡和衰老等相关，通过抑制细胞的生长，从而预防癌症的发生发展[41-42]。这些核心蛋白靶点主要参与了免疫调节与炎症反应等过程。

结合KEGG通路和GO功能富集分析结果表明，高频核心药物可能通过AGE-RAGE、IL-17、IBD、Th17细胞分化等信号通路发挥作用，核心靶点蛋白主要参与了细胞迁移的正向调节、细胞因子介导的信号通路、细胞间黏附的正向调节、细胞活化、炎症反应、转录调节复合物、细胞因子受体结合等过程，从而影响UC的发生发展，起到治疗UC的作用。IL-17是由Th17产生的炎症因子，可促进T细胞的激活和刺激细胞间黏附分子1（ICAM-1），进而引发炎症级联反应[43]；调节性T细胞（Treg）属CD4+T细亚群，分泌IL-10，诱导和维持机体的免疫耐受，在人体自身免疫平衡中扮演重要角色，调节两者保持动态平衡，共同维持肠黏膜免疫稳态[44-45]。这与课题组的前期研究结果一致，黄连主要成分小檗碱通过调节结肠中的肠道微生物群来调节Treg/Th17平衡以治疗UC[27]。

但本研究仍存在一定局限性，基于专利数据库数据挖掘方法仅简单地统计分析出用药频次，未能充分考虑中医辨证论治的特点，且部分专利的药物用量未知，医家的用药经验不一。此外，获得了可能的关键蛋白靶点及其作用的信号通路，未能进一步采用体内外实验来验证其预测的准确性，缺乏实验研究数据支撑。因此，这些局限性仍需在今后的研究中进一步完善和补充。

4 小结

本研究通过数据挖掘的方法对国家专利数据库中治疗UC专利复方的用药规律进行深入总结分析，分析其用药特点和配伍规律，选取高频核心药物，借助网络药理学筛选主要活性成分和核心作用靶点，构建PPI网络、中药-成分-靶点-疾病网络和信号通路的富集分析，初步阐明高频核心药物多组分、多靶点治疗UC特点，为临床医师遣方用药提供了一定理论依据，也为中药治疗UC的基础研究提供了预测思路。