马翠霞 封露露 马倩倩 李 扬 封纪珍

1.石家庄市妇幼保健院遗传科（河北石家庄 050051）；2.石家庄市第四医院体检中心（河北石家庄 050000）；3.石家庄市妇幼保健院产前诊断科（河北石家庄 050051）

高苯丙氨酸血症（hyperphenylalaninemia，HPA）主要是由苯丙氨酸羟化酶（phenylalanine hydroxylase，PAH）或其辅酶四氢生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4）缺乏引起的常染色体隐性遗传病，为最常见的一种氨基酸代谢障碍性疾病[1]。HPA 在不同地区、不同人群间发病率有很大不同，相关PAH基因的变异位点也有很大差异。本研究通过分析石家庄市新生儿HPA筛查及患儿基因检测结果，了解石家庄市新生儿HPA发病及基因变异情况，完善石家庄HPA患儿的基因突变谱，为进一步遗传咨询提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择石家庄市新生儿疾病筛查中心负责的22个区县107所医疗机构2017年3月至2021年5月出生的新生儿495 740例。纳入标准：①出生后3～20 d；②充分哺乳（6～8次以上）后采集足跟血。排除标准：①重复报告；②数据不完整；③死亡；④失访。

本研究获石家庄市妇幼保健院伦理委员会批准（No.202036），研究对象监护人签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 足跟血采集方法 75%乙醇消毒，使用一次性采血针刺于足跟内或外侧，深度＜3 mm，弃去第1滴血后取样，用与试剂盒质控血片一致的903号血片接触血滴，使其自然渗透，采集3 个直径＞8 mm的血斑，自然晾干，置4～8 ℃保存，每周定期送至筛查中心，筛查中心收到样本后于5 个工作日内进行检测并出具可疑结果。

1.2.2 筛查方法及诊断标准 苯丙氨酸（Phe）测定采用免疫荧光法，试剂为芬兰Labsystems 新生儿Phe 浓度测定试剂盒，仪器为芬兰Wallac 公司半自动VICTOR2D 1420 时间分辨荧光免疫分析仪。严格按照说明书进行检测。初筛及复查血Phe 浓度＞2.0 mg/dL（120 μmol/L）为阳性。筛查阳性者召回采血测定Phe 浓度仍＞2.0 mg/dL，并且苯丙氨酸/酪氨酸（Phe/Tyr）＞2.0 确诊为HPA；进行尿蝶呤谱分析以区分PAH 缺乏症和BH 4缺乏症。

患儿根据治疗前最高血Phe 浓度分为经典型苯丙酮尿症（classic phenylketonuria，cPKU，Phe≥1 200 μmol/L）、轻度PKU（mild phenylketonuria，mPKU，360 μmol/L ≤Phe＜1 200 μmol/L）和轻度高苯丙氨酸血症（mild hyperphenylalaninemia，MHP，120 μmol/L≤Phe＜360 μmol/L）。

1.2.3PAH基因检测 采用基因测序技术对患儿及其父母PAH基因进行检测。患儿及其父母静脉血用乙二胺四乙酸抗凝后严格按照说明提取DNA，并对提取物进行质检，后进行基因组文库构建。标记探针与文库DNA杂交，用磁珠结合探针以抓取目的基因，磁珠被磁力架吸附洗脱纯化，目的基因得以富集，进而进行高通量测序。所有数据进行单核苷酸序列多态性分析（single nucleotide polymorphisms，SNP），检测到的变异位点按照美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）指南进行致病性分析。未报道的新发变异使用MutationTaster、GERP++、SIFT、PolyPhen_2、REVEL等功能预测软件进行致病性预测。对发现的致病变异在其所在片段上、下游设计引物进行扩增及Sanger测序，进一步验证测序结果，采用Sanger 法对患儿父母进行目标基因变异验证，基因测序相关工作由北京迈基诺医学检验所完成。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析。计量资料符合正态分布的以均数±标准差表示，非正态分布的以中位数M（P25～P75）表示。计数资料以例数（百分比）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPA筛查情况

符合纳入标准的新生儿487 413例。根据排除标准排除33例，最终入组487 380例。其中男252 521例、女234 859例，采血中位日龄为3.0（3.0～4.0）d，新生儿筛查Phe浓度为0.6（0.3～0.8）mg/dL。筛查出阳性患儿191例，确诊HPA 104例，均为PAH缺乏症。其中男55例、女49例，HPA发病率为1/4686。男婴（2.2/万）与女婴（2.1/万）HPA发病率差异无统计学意义（χ2=0.05，P=0.827）。104例HPA患儿中61例为MHP（58.7%），23例为mPKU（22.1%），20例为cPKU（19.2%）。见表1。

表1 487 380例新生儿HPA筛查情况及临床表型

2.2 PAH基因变异类型及特点

104 例HPA 患儿208 个等位基因中，共检测到209 个PAH基因变异位点，62 种基因变异，所有检测到的变异均来自患儿父母。在209 个PAH基因变异位点中，8 个最常见的变异占总数56.0%，即c.158G＞A（39/209，18.7%）、c.728G＞A（22/209，10.5%）、c.611 A＞G（14/209，6.7%）、c.331 C＞T（10/209，4.8%）、c.721 C＞T（10/209，4.8%）、c.442-1G＞A（8/209，3.8%）、c.1068C＞A（7/209，3.3%）、c.1197 A＞T（7/209，3.3%）。PAH基因变异位点分布不均匀，涵盖范围较广，主要在外显子7（40/209，19.1%）、外显子2（39/209，18.7%）、外显子3（23/209，11.0%）、外显子6（22/209，10.5%）、外显子11（22/209，10.5%）。104例HPA患儿中3例为杂合变异（2.9%），3例为纯合变异（2.9%），98例为复合杂合变异（94.2%）。62 种变异位点中涉及6种变异类型，包括37个错义变异、10个剪接变异、7个无义变异、2个同义变异、1个整码变异、5个杂合变异。

在MHP患儿中最常见的变异位点有c.158G＞A（37/209，17.7%）、c.728 G＞A（8/209，3.8%）、c.611 A＞G（8/209，3.8%）、c.320 A＞G（5/209，2.4%）；mPKU患儿中最常见的变异位点有c.721C＞T（9/209，4.3%）、c.728G＞A（7/209，3.4%）、c.611A＞G（4/209，1.9%）；cPKU患儿中最常见的变异位点有c.728G＞A（7/209，3.45%）、c.331C＞T（6/209，2.9%）、c.1068 C＞A（5/209，2.4%）、c.442-1 G＞A（4/209，1.9%）。

2.3 PAH基因片段缺失及未报道基因变异情况

石家庄市新生儿HPA 患儿中发现5 种杂合缺失，分别位于外显子1及上游区域、内含子1、内含子3、外显子4～5、外显子6，片段缺失分析结果见图1。经HGMD文献数据库检索外显子6杂合缺失未有与PAH相关的报道。

图1 HPA 患儿PAH 基因缺失重复分析结果

基因变异位点c.630 T＞G、c.61-1 G＞A、c.912+5 G＞T 和c.1055+241 C＞A 经HGMD 文献数据库检索未有相关报道，ClinVar数据库无该位点致病性结果分析。1 例患儿同时携带c.630 T＞G 与c.61-1 G＞A 两个位点，临床表型为MHP，这两个位点蛋白功能预测软件预测为有害、未知，ACMG致病性分析为临床意义未明、疑似致病性变异。c.912+5 G＞T 蛋白功能预测软件为未知，ACMG致病性分析为临床意义未明，该患儿临床表型为mPKU。c.1055+241C＞A蛋白功能预测软件为未知，ACMG致病性分析为临床意义未明，该患儿临床表型为MHP。见图2。

图2 HPA 患儿HGMD 文献数据库未报道基因测序图

3 讨论

食物中蛋白质分解形成的Phe 在正常状态下由肝脏PAH作用转变为Tyr，如果PAH缺乏会导致血中Phe 含量升高，通过血脑屏障在脑部蓄积，进而导致神经系统损害[2]。BH 4 是Phe、Tyr 代谢过程中的辅酶，BH 4 还原酶缺乏也会导致HPA，引起神经递质多巴胺和5-羟色胺合成障碍，损害神经系统。HPA根据病因分为PAH缺乏症和BH4缺乏症，在我国85%～90%为PAH缺乏症[3]。

HPA 在不同的国家和地区发病率有很大差异，有资料显示，欧洲不同国家HPA 的发病率为1/3000～1/30000[4]，在亚洲国家中泰国较低为1/327740[5]。我国HPA发病率在南、北方地区有所不同，南方地区发病率在1/81976～1/10567之间[6-7]，北方地区在1/5452～1/3495 之间[8-9]。石家庄市发病率为1/4686，明显高于南方地区，与北方地区一致，符合HPA 南低北高的特点。本研究HPA患儿基因变异以错义变异为主，发生率较高的位点为c.158G＞A（p.R53H）、c.728G＞A（p.R243Q）与c.611 A＞G（p.Y 204 C），与一些学者研究结果一致[5,10-11]，青岛、陕西与本地区略有差异[12-13]。青岛c.611A＞G（p.Y204C）发生频率较低，陕西c.728G＞A（p.R243Q）与c.721C＞T（p.R241C）发生频率最高，甘肃c.1068C＞A与c.1238G＞C发生频率较高。

本组携带c.158 G＞A（p.R 53 H）变异位点的39 例患儿中37 例临床表型为MHP（1 例患儿携带3 个变异位点，其中2 个为c.158 G＞A），1 例患儿为mPKU，1 例为cPKU。这与相关研究的结论，即c.158 G＞A（p.R 53 H）变异对PAH 酶活性影响较低一致[11]。1例cPKU患儿所携带的位点为c.158G＞A、c.194 T＞C 和c.842+2 T＞A，预测这3 个位点的复合作用对PAH酶活性的影响较大。携带c.728G＞A（p.R 243 Q）变异的21 例患儿中8 例临床表型为MHP，7 例为mPKU，6 例为cPKU 患儿（1 例患儿携带2 个c.728 G＞A 变异位点，为纯合变异）。相关研究显示c.728G＞A（p.R243Q）变异对酶活性影响较大[14]，而本研究中携带该变异的患儿临床表型与此结论略有差异。携带c.611A＞G（p.Y204C）变异的14 例患儿中8 例临床表型为MHP，4 例为mPKU，2例为cPKU。有研究显示c.611A＞G（p.Y204C）变异对PAH 酶活性影响不大[15]，2 例cPKU 患儿携带的变异位点分别为c.611A＞G和c.331C＞T、c.611A＞G和c.1068C＞A，考虑c.331C＞T与c.1068C＞A这两种变异可能对PAH酶活性的影响作用较大。本研究中变异位点导致的不同临床表型与其他研究结果较为一致[6]。

中国人群PAH 缺乏症患者携带包括点变异和片段缺失的多种基因变异。石家庄市新生儿HPA患儿中变异频率最高的区域是外显子7，而河南地区为外显子6[16]。本组5种片段缺失中外显子6杂合缺失在HGMD数据库未有PAH基因相关性的报道，该患儿携带的另外1个位点为c.611A＞G，临床表型为mPKU，与前期研究中变异c.611 A＞G（p.Y 204 C）对PAH 酶活性影响情况一致[23]。HGMD 数据库中未报道的基因变异为c.630 T＞G、c.61-1 G＞A、c.912+5G＞T和c.1055+241C＞A，其中c.630T＞G与c.61-1 G＞A 存在于同一例患儿，该患儿临床表型为MHP。携带c.912+5G＞T变异的患儿，另1个变异为外显子4～5 片段缺失，临床表型为mPKU；携带c.1055+241 C＞A 变异的患儿，另1 个变异为c.721C＞T，临床表型为MHP。

本研究显示，石家庄HPA 患儿基因变异以错义变异为主，发生率较高的位点为c.158 G＞A、c.728G＞A和c.611A＞G，分布区域以外显子7为主。本研究明确了石家庄市HPA患儿基因变异的类型和特点，发现外显子6杂合缺失以及c.630T＞G、c.61-1G＞A、c.912+5G＞T和c.1055+241C＞A 5个变异在HGMD数据库无相关报道，丰富和完善了石家庄市HPA患儿的基因变异图谱，为患儿家庭进行遗传咨询和产前诊断提供了重要的补充资料。