倪美艳 王一清 付虎 向龙 周瑜

(1.成都市第一人民医院新生儿科,四川 成都 610016;2.成都市第一人民医院产科，四川 成都 610016；3.四川大学华西第二医院儿童重症医学科,四川 成都 610041)

孕期酒精摄入可引起胎儿酒精综合征(Fetal alcohol syndrome,FAS)，其主要以宫内发育迟缓、神经系统发育迟滞、心脏及颅面发育畸形为主要临床特征[1-3]。目前存在饮酒习惯的女性人数日趋上升，有研究[4]证实，即使在孕早期聚会饮酒也可导致FAS发生。因此FAS发生机制的探讨仍然十分重要。在FAS众多并发症中，出生低体重常被忽视，因为婴儿生后多数会出现体重追赶。但出生低体重提示胎儿宫内生长受限，目前肥胖、糖尿病、高血压等代谢性疾病与宫内发育相关的学说已被学者所接受，出生低体重与成年后代谢性疾病发生密切相关[5-8]。已有研究[9]发现孕期酒精暴露可致子代心脏发育过程中组蛋白乙酰化修饰紊乱，而P300是介导组蛋白乙酰化修饰的关键酶之一，其对基因转录调控的作用已为学者所公认[10]，因此p300介导的组蛋白修饰为FAS的病理机理研究提供新方向。孕期酒精摄入可致后代宫内发育迟缓而出现出生低体重，因此本研究构建了FAS模型小鼠，以组蛋白乙酰化修饰为研究切入点，探讨孕期酒精暴露致子代宫内生长受限的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型构建 选取SPF级c57小鼠(购于四川大学华西基础医学院动物中心)60只。按照雌雄2：1合笼，次日清晨观察雌鼠阴栓，有阴栓者即为妊娠成功(妊娠成功30只)，记妊娠0.5 d，即胎鼠胎龄E 0.5 d。此时开始给予孕鼠50%酒精灌胃，剂量为5 μL/g/d，连续灌胃14 d，设为实验组，酒精灌胃剂量参照文献设定[10-11]，灌胃14 d后小鼠处于胚胎14.5 d，此时期四腔心结构已形成；另设对照组，予生理盐水(0.9% NaCl)灌胃。实验组及对照组每组各12只(6只雌鼠灌胃失败未纳入实验)。实验终点(E 19.5 d)利用二氧化碳(CO2)处死实验动物，随即取出胎盘组织。本研究符合动物伦理要求，通过医院伦理委员会审核批准(批准号：2020028)。

1.2 主要试剂和仪器 100%乙醇(Sigma试剂，上海)；抗VEGF小鼠抗体(Abcam，ab46154)；抗β-actin小鼠抗体(Abcam，ab8227 )；ChIP级抗p300小鼠抗体(Abcam，ab54984)、染色质免疫功共沉淀试剂盒(Abcam，ab500)；HDAC酶及HAT酶活性检测试剂盒(Biovision);二抗IgG(Abcam190475)；全蛋白提取试剂盒(凯基生物，KGP250)；RNA提取试剂盒(Solabio，R1200)；逆转录试剂盒(Qiagen 205111)；荧光定量PCR试剂盒(赛默飞 A25741)。

1.3 方法

1.3.1 检测E19.5 d胎鼠重量 孕鼠分娩期为妊娠后20～21 d，故在妊娠19.5 d，剖宫产获取胎鼠及胎盘组织。对E19.5 d胎鼠进行体重称量，小鼠生后每周称量体重至4周。本次研究中无早产小鼠。

1.3.2 化学比色法及荧光检测法 获取新鲜胎盘组织后随即予以匀浆，匀浆后按照HDACs和HATs活性测定试剂盒指示，对胎盘组织中HATs和 HDACs活性进行检测。

1.3.3 实时定量PCR实验 按照RNA提取试剂盒说明提取组织中总RNA，定量1ug，进行逆转录获得cDNA，进行后续荧光定量PCR实验。各基因引物序列：p300上游5′-GAGACGCATAGGAATTTGC-3′ 下游5′-AGAGGCCTGGG TCTGACAT-3′，产物136 bp；PCAF的上游5′-ATACCTTCTCGGATGTCTGAT-3′，下游5′-TGGAGCTAACGATAAGTACCA-3′，产物133bp；VEGF上游5′-CGTGAATCAGTACACTAGT-3′ 下游5′-ACTGCTTAAGTCGTGCTCATG-3′，产物长度为125 bp；β-actin作为内参基因。Bio-Rad-CFX96 荧光定量PCR 仪器“gene expression”模块(基于Pfaffl 原理)对各基因相对β-actin表达量进行统计、分析。

1.3.4 Western blot实验 利用前文所及全蛋白提取试剂盒对组织中总蛋白，利用BCA法进行标准曲线绘制，并计算各组蛋白浓度。SDS-聚丙酰胺凝胶选择浓度未10%，蛋白上样量为30 μg，90v电泳30 min后换电压至120 v电泳至溴酚蓝接近胶底部。250mA湿转1.5 h至0.22 μm的PVDF膜上。封闭液(5%脱脂奶粉)1 h后孵育一抗，4 ℃ 16 h；洗膜后孵育 二 抗(1∶3000)1.5 h(室温)，PBST洗膜后发光成像。统计各组条带灰度值，β-actin为内参，计算蛋白的相对表达量(利用Quantity one软件)。

1.3.5 染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation，ChIP)实验 按试剂盒指示进行染色质免疫共沉淀实验：①称取胎盘组织100 mg，充分匀浆，弃上清后加入1%的甲醛进行交联反应。②利用超声将大片段DNA进行切割，片段长度介于200～1000 bp为宜。③加入p300 ChIP 级抗体，在4 ℃下沉淀目的DNA。④65 ℃条件下进行逆转交联，并进行DNA纯化，所得DNA进行后续PCR实验。

1.3.6 ChIP-qPCR实验 针对VEGF基因启动子区域利用Primer Premier 5.0软件进行引物设计。引物blast比对无误后送公司合成。VEGF的上游序列：5′-GCCGTAATTACGCTGGCTTACCA-3′，下游序列：5′-CGCATATGACGCGATGACATGGT-3′，产物大小为169 bp。

2 结果

2.1 子代小鼠出生重量及生后体重 新生小鼠生后当天即进行称重，实验组小鼠E19.5 d体重(0.93±0.12)g，较对照组(1.33±0.13)g明显降低(P<0.01)。小鼠生后每周称量体重至4周，生后1周、2周实验组小鼠体重仍落后于对照组(P<0.05)，提示生长发育落后。见表1。

表1 子代小鼠体重Table 1 F1 birth weight

2.2 胎盘组织中HATs及HDACs酶活性 胎盘组织中HATs酶活性实验组明显低于对照组(P<0.01)；总HDACs酶活性两组比较差异无统计学意义(P>0.05),见图1。

图1 两组HATs及HDACs活性检测Figure 1 HATs and HDACs activities in different groups注：与对照组比较，①P<0.05

2.3 VEGF、p300和PCAF 基因转录表达水平 VEGF在实验组胎盘组织中mRNA水平较对照组显著降低(P<0.01)；与对照组相比，p300在实验组胎盘中表达显著降低(P<0.05)；而PCAF表达在两组间差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 p300、PCAF和VEGF mRNA相对表达量Figure 2 mRNA expression levels in different groups注：A.VEGF mRNA相对表达量在实验组中明显下降；B.p300 mRNA相对表达量在实验组中明显下降；C.PCAF mRNA相对表达量在两组间无统计学差异。与对照组比较，①P<0.05

2.4 VEGF蛋白在各组间表达水平 实验组中VEGF蛋白较对照组显著降低(P<0.01)，见图3。

图3 VEGF蛋白表达量水平Figure 3 VEGF protein levels in trial and control group注：与对照组比较，①P<0.05

2.5 p300与VEGF启动子结合水平 P300与VEGF启动子结合区域水平实验组较对照组显著降低(P<0.05)，见图4。

图4 p300与VEGF启动子结合水平Figure 4 Binding level of p300 with promoter of VEGF注：与对照组比较，①P<0.05

3 讨论

随着科学研究的不断深入，诸多代谢性疾病宫内发育起源的学说逐渐为学者所认可，目前人群及动物研究均已证实宫内发育迟缓与成年期诸多代谢性性疾病相关，如高血压、肥胖、II型糖尿病、高脂血症等[11]。孕期酒精暴露是导致宫内生长受限的重要原因，本研究成功构建胎儿酒精综合征动物模型，子代小鼠体重显著降低。这与以往FAS研究[12-13]报道相符。

胎盘是维系子代宫内发育的重要纽带，其宫内的正常维系是子代发育的决定性因素之一。有报道[14-16]显示饥饿、孕期药物滥用等等孕期不良因素暴露均可引起胎盘损伤。而胎盘损伤是胎儿宫内生长迟缓(IUGR)发生的关键因素之一[17-18]。数据首次提示孕期酒精干预可致胎盘组织中VEGF表达明显降低，而VEGF在血管发生中的关键作用已得到公认[19-21]。本研究结果发现VEGF的下降存在于mRNA和蛋白质层面，这提示其降低是发生在转录层面的。近10年陆续有研究[22-23]提示胎儿酒精综合征动物模型中肝脏、心脏组织中组蛋白乙酰化失衡，进而引起发育异常。组蛋白乙酰化于基因转录调控影响重大，通过影响染色质结构的稳定而动态且可逆的调控基因转录[24-25]。组蛋白乙酰化受HAT酶及HDAC酶动态调控。所以同时检测了胎盘组织中HATs和HDACs的总体活性，结果发现HATs酶活性显著下降，而HDACs酶活性无明显改变，这提示孕期酒精暴露可能通过HATs酶而影响胎盘中基因转录表达。因此在后续实验中，我们分别检测了HATs酶的重要亚型--p300及PCAF的表达情况，其在胎儿FAS模型小鼠心脏中均出现表达异常[23]。数据提示仅有p300在酒精暴露组及对照组之间存在差异，这提示HATs酶的重要亚型p300很有可能介导了胎盘组织的组蛋白乙酰化失衡。P300作为重要HAT酶，可通过直接调控靶基因启动子区域组蛋白乙酰化水平影响该基因表达[26]，因此实验中检测了p300与VEGF启动子区域的结合水平，数据证实孕期酒精暴露导致胎盘组织中p300活性降低，其可能介导了重要血管发生因子VEGF的低表达，引起胎盘受损而带着胚胎宫内生长受限。

胎儿宫内生长受限受多因素影响[27]，胎儿宫内生长受限会引起围生儿发生不良妊娠结局,应加强胎儿宫内生长受限的早期筛查,解除高危因素,改善妊娠结局。本研究从表观遗传角度探讨了宫内生长发育迟缓的可能机理，组蛋白乙酰化酶p300可能在此病理发生中扮演重要角色。鉴于组蛋白乙酰化修饰具有可逆的特点，因此这为孕期酒精暴露的早期干预提供了可能理论靶点。然而在这一病理过程中，是否存在其他胎盘受损，如凋亡等因素存在以及能否利用p300为切入点改善宫内生长受限，这些问题仍需扩大样本量要进一步深入研究。

4 结论

本研究结果提示，孕期酒精暴露通过p300介导组蛋白乙酰化修饰下调胎盘组织中VEGF表达，进而引起子代宫内发育受限。目前妊娠后发现有饮酒史的妇女逐渐增多，因此本研究有望对备孕家庭咨询以及误饮酒孕妇咨询提供一定借鉴，同时有望为胎儿酒精综合征的临床治疗转化提供可能靶点。