刘向东，钱军华，王威

自 1986年全球首个单抗药物批准上市以来，经过30 多年的发展，单抗目前已成为全球生物制药增长最快的细分领域。近年来我国的抗体药物也有了迅速的发展，截至2021年 11月，已批准上市的国产单抗药物数量达 31 个[1]。生产中单抗药物主要通过基因工程技术构建表达质粒并转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO 细胞），经 CHO 细胞生长培养表达所需蛋白并纯化获得抗体原液，最后制剂灌装得到单抗成品。为了更好地保护蛋白的稳定，保证原液的质量，延长有效期，抗体原液一般都选择低温冷冻保存，灌装时重新解冻后使用。有研究显示抗体原液在冻融过程中，在-5 ～ 0 ℃ 时发生相变（固液两态转化），形成冰晶体，内部溶质产生冷冻浓缩，酸碱度失衡，局部 pH 值及离子强度发生变化，蛋白发生聚集[2-4]。抗体的聚集大多都是不可逆的，有学者提出了抗体聚集物有可能通过两种途径使正在接受抗体类药物治疗的患者产生免疫原性：T 细胞依赖途径以及细胞因子激活途径，而且分子量越大的聚集物其免疫原性越强，最终，免疫原性反应不仅大幅降低了药物体内的疗效，而且易引发 I 型超敏反应[2]。因此有必要针对抗体原液冻融过程稳定性及影响因素进行研究，以及建立稳定的原液冻融工艺，指导生产。

以公司在研的单抗产品为例，参照《中华人民共和国药典》2020年版（ChP 2020）四部中“生物制品稳定性试验指导原则”，通过缩小模型实验探究固有因素和可变因素在冻融过程中对原液蛋白稳定性的影响。固有因素包括分子类型和蛋白浓度；可变因素包括原液的包装形式、包装规格和冻融条件。因对目标函数（蛋白质量）没有充分的实验数据分析和预判，所以选择单因素“优选法”（即斐波那契法）进行实验设计，每个实验因素包含不同的水平。实验结束后通过不同的策略组合，运用统计学原理分别以横向与对照品（未经冻融的样品）进行比较，纵向与不同分子类型、蛋白浓度、包装形式、包装规格以及冻融条件进行比较，以探讨抗体原液冻融过程稳定性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验样品 选用 5 种抗体原液，分别为原液 1（蛋白浓度：50 mg/ml，IgG1 野生型）、原液 2（蛋白浓度：10 mg/ml，IgG1 突变型）、原液 3（蛋白浓度：50 mg/ml，IgG1 突变型）、原液 4（蛋白浓度：150 mg/ml，IgG1 突变型）、原液 5（蛋白浓度：50 mg/ml，IgG4 突变型），均为本公司产品。

1.1.2 仪器和设备 -60 ℃ U410-86 型超低温冰箱为德国Premium 公司产品；34970A 型多路温度记录仪购自安捷伦公司；所用材料：冻存瓶（规格：125 ml、500 ml 和1000 ml，材质：聚碳酸酯）购自美国 Nalgene 公司；冻融袋（规格：125 ml、500 ml 和 1000 ml，材质：多层复合膜）购自美国Thermo 公司。

1.2 方法

1.2.1 稳定性研究方法

1.2.1.1 样品冷冻 按照表1 实验设计，每个容器分装80% 标识体积的原液，插入温度记录探头，使其垂直悬空在溶液中心位置，将所有样品一起放入 -60 ℃ 冰箱，开启多路温度记录仪记录温度曲线。待所有样品温度都降至-60 ℃ 以下，保持 4 h 以上，使产品彻底冻结。

表1 实验设计

1.2.1.2 样品解冻 解冻时分别置于不同实验条件下静止解冻，至所有冰晶体全部融解，解冻结束。

1.2.1.3 反复冻融 选取样品 1（IgG1 野生型）、样品 4（IgG1 突变型）和样品 7（IgG4 突变型）3 种不同分子类型样品按照实验 1、4 和 7 条件反复冻融 3 次，考察反复冻融对蛋白稳定性影响。

1.2.1.4 样品检测 样品解冻后取样按照 ChP 2020三/四部中相关测定方法进行 pH、蛋白含量、不溶性微粒、分子排阻-高效液相色谱（size exclusion chromatography-high perfermance liquid chromatography，SEC-HPLC）、离子交换-高效液相色谱（cation exchanged-high perfermance liquid chromatography，CEX-HPLC）、毛细管电泳/非还原法（non-reduced capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfate，NrCE-SDS）、毛细管电泳/还原法（reduced capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfate，rCE-SDS）、结合活性和细胞生物学活性（或竞争活性）检测。

1.2.2 冻融工艺建立方法

采用“4 + 2”的模式建立抗体原液冻融工艺，如图1所示。“4”是指 4 步操作：①设计不同冻融条件，通过缩小模型进行实验；②确定蛋白质量稳定的最长相变时间；③选择放大后包装材料及冻融条件；④结合冻融条件确定冻融参数，建立冻融工艺。“2”是 2 个原则：①是保持相变时间不变的原则进行工艺放大；②尽量避免反复冻融。

图1 抗体原液冻融工艺建立

2 结果

2.1 稳定性研究结果

2.1.1 相变时间

相变时间是抗体原液冻融过程中，固-液两种形态转化时所持续的时间，一般在 -5 ～ 0 ℃ 之间，在冻融曲线中近似为一条直线。根据温度记录曲线，不同实验条件下原液在冻融过程中相变时间如表2。

表2 相变时间（min）

2.1.2 样品检测 每个实验编号对应样品号（例，实验编号 1 对应样品 1），样品检测结果如表3。

表3 样品检测结果

2.1.3 固有因素和可变因素对冻融稳定性的影响

2.1.3.1 固有因素冻融稳定性结果（图2） 结果显示：①与对照品相比，IgG1 野生型、IgG1 突变型和 IgG4 突变型三种不同分子类型的原液冻融后样品 pH、蛋白含量、CEX-HPLC 酸性峰、NrCE-SDS 纯度、rCE-SDS 纯度、结合活性及生物学活性（或竞争活性）均未发生明显变化，三种分子类型的原液不溶性微粒均稍有增加；IgG1 野生型和IgG1 突变型 SEC-HPLC 聚体含量未有明显变化，而 IgG4突变型 SEC-HPLC 聚体含量增加 85.7%；②与对照品相比，IgG1 突变型抗体不同蛋白浓度（10 mg/ml、50 mg/ml和 150 mg/ml）原液冻融后样品 pH、蛋白含量、SEC-HPLC聚体含量、CEX-HPLC 酸性峰、NrCE-SDS 纯度、rCE-SDS纯度、结合活性及生物学活性与对照品相比均未发生明显变化，3 种蛋白浓度的原液冻融后不溶性微粒均稍有增加。

2.1.3.2 可变因素冻融稳定性结果 固有因素中通过对不同分子类型和不同蛋白浓度的原液冻融稳定性分析，IgG4突变型分子冻融过程中存在不稳定现象。因此在可变因素中选择以 IgG4 突变型原液就不同包装形式、包装规格和冻融条件进行稳定性研究。结果（图2）显示：①与对照品相比，IgG4 突变型抗体原液在冻存瓶和冻融袋两种包装形式中冻融后样品 pH、蛋白含量、CEX-HPLC 酸性峰、NrCE-SDS纯度、rCE-SDS 纯度、结合活性及竞争活性均未发生明显变化，不溶性微粒均稍有增加；SEC-HPLC 聚体含量增加明显，且同等规格下冻存瓶聚体含量增加更为明显，125 ml和 500 ml 规格结论一致，冻存瓶中聚体含量分别较冻融袋增加 62.5% 和 33.3%，较对照品增加 85.7% 和 185.7%；②与对照品相比，IgG4 突变型抗体原液在冻存瓶中由 125 ml放大至 500 ml，冻融袋中由 125 ml 放大至 500 ml 和1000 ml，冻融后样品 pH、蛋白含量、CEX-HPLC 酸性峰、NrCE-SDS 纯度、rCE-SDS 纯度、结合活性及竞争活性均未发生明显变化，不溶性微粒稍有增加；SEC-HPLC 聚体含量增加明显，且随着包装规格的增大，聚体含量增加越多，冻存瓶规格增大 4 倍时，聚体含量增加 53.8%，冻融袋规格增大 4 倍时，聚体含量增加 87.5%，冻融袋规格增大8 倍时，聚体含量增加 175%；③与对照品相比，IgG4 突变型抗体原液在冷冻条件（-60 ℃ 冰箱和 -60 ℃ 冰箱 +泡沫箱）和解冻条件（25 ℃ 室温、25 ℃ 水浴、8 ℃ 环境和冰水浴）冻融后样品 pH、蛋白含量、CEX-HPLC 酸性峰、NrCE-SDS 纯度、rCE-SDS 纯度、结合活性及竞争活性均未发生明显变化，不溶性微粒均稍有增加；不同冷冻条件对 SEC-HPLC 聚体含量增加影响较小，不同解冻条件对聚体含量增加影响明显，8 ℃ 环境解冻时聚体含量增加400%。

图2 不同实验条件下 SEC-HPLC 聚体检测结果（样品 5 ～ 13 横向对照均为对照 5）

2.1.4 反复冻融对稳定性的影响 结果（图3）显示：①与对照品相比，IgG1 野生型、IgG1 突变型和 IgG4 突变型三种不同分子类型的原液反复冻融三次后样品 pH、蛋白含量、CEX-HPLC 酸性峰、NrCE-SDS 纯度、rCE-SDS纯度、结合活性及生物学活性（或竞争活性）均未发生明显变化，不溶性微粒均稍有增加，且与冻融次数成正比例增加；② IgG1 野生型和 IgG1 突变型 3 次反复冻融后，SEC-HPLC 聚体含量未有明显变化，IgG4 突变型反复冻融后，聚体含量增加明显，且与冻融次数成正比例增加。

图3 反复冻融后不溶性微粒和 SEC-HPLC 聚体检测结果

2.2 冻融工艺建立

以本公司在研的某 IgG1 突变型抗体原液为例简单介绍冻融工艺建立的过程，为读者提供参考。通过缩小模型选用 125 ml 冻存瓶进行实验，冻融曲线如图4 所示。

图4 IgG1 突变型抗体原液冻融曲线（温度探头 CH.101 ～ CH.104 分别检测样品 C、样品 B、样品 D 和样品 A 的温度，CH.105 ～ CH.109 检测环境温度）

由冻融曲线可知，样品 A ～ 样品 D 的相变时间分别为 70 min、145 min、220 min 和 480 min。

样品解冻后取样按照 1.2.1.4 检测方法进行蛋白含量、不溶性微粒、SEC-HPLC 聚体、CEX-HPLC 酸性峰、NrCE-SDS、rCE-SDS、结合活性和生物学活性检测来分析不同相变时间对蛋白稳定性影响，解冻后样品检测结果如表4。

表4 缩小模型原液冻融检测结果

与对照品相比，该抗体原液经最长相变时间 480 min冻融后，其蛋白含量、SEC-HPLC 聚体、CEX-HPLC 酸性峰、NrCE-SDS、rCE-SDS、结合活性和生物学活性均未发生明显变化，不溶性微粒有增加，但在质量标准范围（10 μm：≤ 6000 个，25 μm：≤ 600 个）限度以内。说明该抗体原液在最长相变时间 480 min 内进行冻融时，质量较稳定。

根据原液产量及每批次灌装需求，放大后选用 1000 ml冻存瓶（分装体积 ≤ 80%）分装冻融，采用 -60 ℃ 冰箱冷冻和水浴解冻的方式，该条件下冻融时间约为 420 min，冻融时间小于 480 min，而相变时间更小，因此认为在该条件下冻融原液质量稳定。最后结合冻融条件确定冻融工艺参数为：1 L 冻存瓶（分装体积 ≤ 80%），冷冻条件为 -60 ℃冰箱，解冻条件为 20 ～ 30 ℃ 水浴。

放大后按照上述冻融参数进行原液解冻后检测，检测结果如表5。

表5 放大后原液冻融检测结果

根据上述检测结果，均符合原液质量标准要求，且与对照品相比，各质量属性均未发生明显变化，说明该冻融工艺参数设定合理，冻融过程能够保证原液稳定性。

IgG4 突变型抗体原液，选用 1000 ml 冻存瓶进行冻融工艺验证，设定冷冻条件为 -60 ℃ 冰箱，解冻条件分别设为（25 ± 2）℃ 水浴和（25 ± 2）℃ 室温，冻融时间分别约为 420 min 和 600 min，相变时间约为 160 min 和380 min。样品解冻后经检测，SEC-HPLC 聚体含量分别为0.7% 和 1.1%，前者较对照品相比聚体含量未有升高，后者升高 57.1%。而缩小模型实验显示该 IgG4 突变型抗体在相变时间为 125 min 时，聚体含量未有变化，相变时间415 min 时，聚体含量较对照品增加 100%，放大后验证结果与缩小模型实验结果基本一致。

3 讨论

根据本文相关研究，IgG1 野生型和 IgG1 突变型分子类型的抗体原液冻融时较稳定，除不溶性微粒稍有增加外，其他质量属性均未见明显变化；IgG1 突变型的三种不同蛋白浓度的原液冻融时，除不溶性微粒稍有增加外，其他质量属性并未随蛋白浓度升高表现差异，说明 IgG1 突变型抗体原液的稳定性在冻融时受蛋白浓度影响较小；IgG4 突变型抗体原液冻融过程存在蛋白不稳定现象，主要表现为SEC-HPLC 聚体含量增加明显，本文研究结果与文献[5]报道结果相一致。有研究显示，蛋白聚集一方面可能是多个蛋白质分子通过非共价键（范德华力、氢键、疏水作用和静电作用）相连接；另一方面可能是通过二硫键等共价键相缔合，称为共价聚集[6]。这两种聚集最终都有可能形成可溶性或不可溶性聚集物。另，本研究所用 IgG4 突变型抗体原液制剂辅料中含有甘露醇，其在低温冻结时容易结晶析出[7]，形成的疏水性界面易引起蛋白聚集，因此辅料的差异可能也是引起聚集体增加的原因之一，读者可进一步展开研究。

原液包装形式、包装规格和冻融条件的不同造成相变时间差异。同规格下在冻融袋中的相变时间小于冻存瓶，主要是因为冻融袋的比表面积大于冻存瓶，冻融过程中热交换速率更快，蛋白在冰晶点停留的时间短，导致同等规格下冻融袋的聚体含量增加慢一些。此外冻融袋和冻存瓶材质不同，可能也是影响热交换速率的因素之一。随着冻存瓶和冻融袋包装规格的增大，相变时间变长，聚体含量也随之增加。不同冷冻条件，产品质量属性未表现出明显差异，可能和实验条件设定冷冻相变时间变化太小有关，读者可通过对冻融速率控制进一步研究不同冷冻过程对蛋白稳定性的影响；不同解冻条件，聚体含量产生明显差异，且解冻越慢，相变时间越长，聚体含量增加越明显。在解冻过程中，外周界面先发生热交换，导致中心的溶质产生浓缩，发生再结晶，再结晶对冰-液界面中的蛋白质施加外界张力或剪切力，使蛋白质发生损害，产生聚集。因此慢速解冻不利于蛋白活性的恢复，推荐进行快速解冻。另，若解冻过程中有气泡掺入也会对蛋白产生不利影响，温和的混匀将减少再结晶，降低浓缩的影响[8-9]。

通过缩小模型确定冻融过程中蛋白质量稳定的相变时间，找到最大设计空间，使得在放大生产时所选冻融条件的相变时间落在设计空间内，并有足够的安全系数。IgG1 抗体原液通过小试研究，其冻融过程中蛋白质量稳定的相变时间较长，放大生产时安全系数较大，冻融条件更容易满足。而 IgG4 突变型抗体原液蛋白质量稳定的相变时间较短，安全系数空间太小，放大生产时应尽可能避免采用冻融工艺，若产品工艺必须采用冻融，应采用全自动冻融系统通过控制冻融速率或其他措施（如由冻存瓶更换为冻融袋，减小包装规格等）严格控制相变时间。