张淑莉 方佳妮 康宝丽 王丹炀 刘欣雨 高瑞鹏

1.西安医学院医学技术学院检验中心 陕西西安 710021；2.西安医学院医学技术学院医学检验技术1936班 陕西西安 710021

对流免疫电泳(counter immunoelectrphoresis，CIEP)是可溶性抗原和抗体在双向免疫扩散的基础上与电泳相结合的定向加速免疫扩散技术。由于电泳技术的采用，使在缓冲液体系中带电的抗原抗体呈定向运动，加快了两者的结合，并且限制了抗原抗体在介质中向四周扩散的倾向，提高了反应时间，显著增加了实验灵敏度[1]，常用于抗原或抗体的定性分析、效价测定及纯度鉴定[2]。对流免疫电泳实验在临床检验和医学院校的临床免疫学检验教学中有很重要意义。对流免疫电泳的原理是在pH值为8.6的琼脂凝胶中，大部分蛋白质抗原等电点低，带较强负电荷，且分子量小，电泳力大于电渗力，在电场中向正极移动；而抗体绝大多数为IgG，因其等电点偏高，在pH值为8.6时带微弱的负电荷，且分子量较大，移动速度慢。因此在电场中电泳力小于电渗力，在电场中移向负极，电泳时，将抗原孔放负极端，抗体孔放正极端，则抗原抗体相向运动，在两孔之间相遇，并在比例适当的部位形成肉眼可见的沉淀线。目前，对流免疫电泳实验广泛应用的缓冲液是巴比妥-巴比妥钠缓冲液[3]。但由于巴比妥-巴比妥钠是一类抑制中枢神经系统的药品，它具有镇定、催眠、麻醉等作用，近年来为国家管制类药品，存在一定安全隐患且价格较高，购买困难，影响了对流免疫电泳实验教学的开展。因此需要找到一种试剂安全性高、实验效果好、试剂成本低又环保的实验材料，来替代巴比妥-巴比妥钠缓冲溶液，在测试多种常见pH值为8.2～8.6的缓冲液后，笔者采用TAE缓冲液应用于对流免疫电泳实验并取得较好效果，并且可以作为医学院校对流免疫电泳实验教学中的新型缓冲液。

1 材料与方法

1.1 实验材料

抗原：正常人新鲜血清；抗体：购买商品(使用前用生理盐水分别做抗体原倍、1∶2、1∶4、1∶8稀释度)，载玻片，打孔器，移液器及移液器吸头，打孔样纸，5ml刻度吸管，洗耳球，牙签，记号笔，湿盒。

1.2 主要器材

电子分析天平，北京六一仪器厂直流稳压电泳仪(DYY-6C)及配套水平电泳槽，湘仪离心机。

1.3 试剂

巴比妥-巴比妥钠电泳缓冲液(pH值为8.6，离子强度0.05)：先称取巴比妥1.84克置于三角烧瓶中，加入200ml蒸馏水，加热溶解后加入巴比妥钠10.3克，最后加蒸馏水至1000毫升(调pH值至8.6)；TAE缓冲液：称取Tris4.84g，Na2EDTA·2H2O0.744g，冰乙酸1.142mL，加蒸馏水至1000ml；琼脂粉凝胶：称取琼脂粉分别加入TAE缓冲液和pH值为8.6的巴比妥-巴比妥钠缓冲液，使琼脂浓度为10g/L，沸水浴中溶解至透亮澄清，放60～70℃水浴箱中保温备用。

2 方法

(1)制板与打孔：取干净载玻片，将1%融化琼脂凝胶4.5ml浇于载玻片上，厚度约1.5～2.0mm。待琼脂凝固后，按打样模板去打孔，标记抗原抗体方向。

(2)加样：在加样孔中加入抗原10μL和抗体10μL。

(3)电泳：将已经加好样的琼脂板平放于电泳槽中，琼脂板两端用纱布搭桥与电泳槽中缓冲液相连接，抗原孔接电源负极，抗体孔接正极，开启电源，调整电压和电流强度，通电50～60min。

3 实验结果

电泳结束后关闭电源，在光线充足的情况下，将玻片对着光，观察载玻片上抗原抗体孔之间是否有白色清晰沉淀线出现，如果有沉淀线形成判定为阳性，无沉淀线出现为阴性。如果沉淀线不够清楚，将湿盒放置37°C保温箱中数小时，可增强沉淀线的清晰度。

(1)以巴比妥-巴比妥钠缓冲液为介质对流免疫电泳电泳图谱见图1(自左上顺时针旋转分别为抗体原倍、1∶2、1∶4、1∶8稀释度)。

图1 以巴比妥-巴比妥钠缓冲液为介质电泳图谱

(2)以TAE缓冲溶液为介质对流免疫电泳电泳图谱见图2。

图2 以TAE缓冲溶液为介质对流免疫电泳图谱

图1、图2分别是以巴比妥-巴比妥钠缓冲液、TAE缓冲液为介质，人血清作为抗原进行的对流免疫电泳，电泳图谱如图1、图2所示：在抗体原倍、1∶2、1∶4、1∶8稀释度条件下均可见清晰白色沉淀线即为抗原抗体复合物。重复多次实验后，比较这两种缓冲液的电泳结果基本相当，但TAE缓冲溶液电泳结果在1∶8稀释度下比巴比妥-巴比妥钠缓冲液1∶8稀释度下的沉淀线更为明显，反应结果更好。

4 结论

“临床免疫学检验技术”主要通过研究免疫学理论和免疫学技术并将其应用于临床样本的定性、定量检测，辅助临床对相关疾病进行诊断的一门重要医学学科，该课程不仅理论性强、技术应用广、实用性强，还与临床微生物学检验、临床血液学检验、临床生物化学检验、临床寄生虫学检验等多学科既广泛联系，又相互交叉，是医学检验专业本科生必修的一门重要的主干课程，临床免疫学检验不仅是临床医生对免疫相关性疾病进行分析和诊断的依据，还对免疫相关疾病的治疗效果和病情判断上有很重要的价值，对临床检测工作起重要指导作用[4]。医学检验专业毕业生大多数从事医学检验相关的工作岗位，实验操作技能是毕业生立足社会的基本能力。所以实验教学是临床免疫学检验教学的重要组成部分，其在培养学生扎实的理论基础和专业技能，建立系统的临床检验思维方面具有重要作用[5]。通过开展临床免疫学检验的实验教学，使学生掌握了各项免疫学技术的检测原理、操作方法、注意事项、临床应用等，了解临床免疫学检验的各种新技术新方法，拓宽学生临床免疫学检验方面的知识视野，不但培养学生熟练的动手操作能力、综合分析问题、解决问题的能力以及科研创新能力，还有助于调动学生学习的主动性和积极性，激发学生学习的兴趣[6-7]，提升学生认识并解决在以后学习和工作中遇到的各种实际问题，以培养适应21世纪医疗卫生发展需要的高质量、应用型医学检验专业技术人才。

目前关于对流免疫电泳缓冲溶液优化的研究并不多见，现就近年来的研究进展进行综述。早期杨瑞景[8]根据电解质的导电性能，尝试使用0.15%的氯化钠溶液替代巴比妥-巴比妥钠缓冲液对乙型肝炎抗原和胎甲蛋白进行检测，该替代缓冲液的优点为经济、快速、简便。其中，氯化钠溶液比巴比妥-巴比妥钠缓冲液价格便宜375倍，并且在临床试验中取得了较好的结果。但在电泳过程中，NaCl缓冲液会被电解产生氯气，对实验者存在一定危害性，因此氯化钠溶液替代巴比妥-巴比妥钠缓冲液的方法并未得到广泛普及。张立红[9]在技术上进行了改进后，选用电泳槽缓冲液pH值为8.6，离子强度由0.1巴比妥盐酸缓冲液或pH值为8.6，离子强度0.06巴比妥缓冲液，该方法不需要昂贵的仪器设备和专供试剂盒，一般实验室就能开展抗原或抗体检测，此方法简便快速、经济，节省了试剂，缩短了实验时间。近年来周瑞雪[10]等人从常用缓冲液中筛选出6种pH值在8.6的缓冲液进行电泳后研究表明，Tris-HCl、巴比妥-巴比妥钠、TAE、Gly-NaOH和NaCl-NaOH缓冲液均可作为对流免疫电泳的缓冲液。但从电泳后抗原抗体形成白色沉淀线的结果来看，Tris-HCl缓冲液在对流免疫中效果最好，它作为缓冲液不仅能产生白色沉淀线，而且有很好的抗体浓度依赖趋势。巴比妥-巴比妥钠、TAE、Gly-NaOH、NaCl-NaOH电泳效果依次次之，TGS缓冲液电泳效果最差，没有白色沉淀线出现，最终认为在对流免疫电泳中，Tris-HCl缓冲液替代传统巴比妥-巴比妥钠缓冲液效果最好。因此认为免疫学实验课中可以将Tris-HCl作为对流免疫电泳的缓冲液。Tris-HCl缓冲溶液、NaCl-NaOH缓冲溶液替代巴比妥-巴比妥钠缓冲液，虽然实验原料易获取，且经济实用，实验效果良好，但对流免疫电泳目前主要应用于教学实验中，这两种缓冲液在实验过程中可能会电解生成有毒气体氯气，以及有强酸、强碱的使用，实验安全性不高，实验过程中可能会危害到实验人员的健康。而TAE缓冲液(TAE Buffer)是由三羟甲基氨基甲烷(Tris base)、乙酸(acetic acid)和乙二胺四乙酸(EDTA)按一定比例配制组成的缓冲液，经过多次重复实验证明，TAE缓冲液的电泳效果较好，在保证对流免疫电泳实验教学质量的前提下，安全性较高，没有强酸，强碱的使用，也没有有毒气体生成，并且实验成本较低，在对流免疫电泳实验中有清晰免疫沉淀线，完全能够替代巴比妥-巴比妥钠缓冲液在对流免疫电泳实验中的使用。本次成功使用TAE缓冲液替代巴比妥-巴比妥钠缓冲液，同时在操作中我们还注意了以下几个方面：

(1)加样时孔内不要有气泡，孔内加入抗原或抗体时以加满为宜，尽量不要外溢；血清标本要尽量新鲜不能用溶血或陈旧标本。

(2)电泳时电压不要太大，免得蛋白质变性，出现假阳性或者假阴性，干扰实验结果。

(3)抗原抗体的含量和比例要合适，否则不会出现明显可见沉淀线。

(4)电泳所需要的时间与孔间距有关，孔间距越大，电泳时间越长。

(5)电场强度、电泳缓冲溶液的pH值、溶液离子强度等对检测结果均有影响，电泳速度与电场强度成正比，电场强度越高，带点颗粒移动速度越快；溶液的pH值高于颗粒的等电点时颗粒带负电荷，溶液pH值离某物质的等电点越远，该物质所带电荷量越多，分子量越小，泳动越快；缓冲溶液的离子强度越高，电泳速度越慢。

在对流免疫电泳实验中电泳介质本实验室一直首选用琼脂粉，在这次实验中也尝试着将电泳介质琼脂粉换成琼脂糖，实验结果显示，琼脂粉的电泳效果均好于琼脂糖，与周瑞雪等研究发现琼脂糖实验效果好于琼脂粉的研究结果不符，这还有待于进一步的探索论证。

综上所述，本文选用TAE缓冲液同传统巴比妥-巴比妥钠缓冲液的电泳结果都有明显沉淀线，但TAE缓冲溶液电泳效果要好于巴比妥-巴比妥钠缓冲液，TAE缓冲液的试剂原料经济安全且容易获取，并且使用琼脂粉作为电泳介质的结果优于琼脂糖，在对流免疫电泳实验教学中作为新型缓冲液完全能替代巴比妥-巴比妥钠缓冲液，目前已经应用于临床免疫学检验实验教学中，取得了良好的实验教学效果，值得推广使用。