汪彩莉，程险峰，李晓环，张 虎

（湖北白云边酒业股份有限公司，湖北松滋 434200）

曲是一种糖化发酵剂，是酿酒的原动力，要酿好酒先得制曲，要酿好酒必须用好曲[1]。大曲不仅是一种糖化发酵剂，对成品酒的香型、风格也起着重要作用[2]。大曲中含有丰富的微生物，主要包括细菌、霉菌和酵母菌三大类，糖化看霉菌，酵母来发酵，生香靠细菌。制好的大曲都需要经过贮存再投入生产使用，这样可以提高大曲酒的质量，因此贮存是制成高质量大曲必不可少的步骤。

白云边酒生产采取高温曲和中温曲分开制曲，结合使用的方式进行，形成了白云边酒特有的制曲工艺体系[3]。高温大曲以纯小麦为原料，经高温培养而成，最高温度控制在65 ℃。培菌完成的大曲运至贮曲库，贮存3～6 个月后，用于酿酒。本课题以贮存中的高温大曲为研究对象，旨在发现贮存过程中高温大曲主要理化指标和微生物生长情况的变化规律，以及两者间的相关性，用于指导高温大曲贮存工作，提高陈曲质量。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 材料

样品来源：各阶段高温大曲均由湖北白云边酒业股份有限公司原料车间提供。

样品处理：选取4 班、5 班、6 班高温大曲若干块，单独放于成品曲仓库内。每次测量时，从同批次曲块上敲取部分曲块粉碎后混匀装入无菌密封碗中并立刻处理。

1.1.2 试剂

平板计数琼脂，北京奥博星生物技术有限责任公司；孟加拉红培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司。

0.1mol/L NaOH 溶液：称取4 g 分析纯氢氧化钠，加少量水溶解，稀释至1 L，摇匀，储存于聚乙烯瓶中（不必标定其浓度）。

斐林氏试液（稀）

甲液：称取15 g 硫酸铜、0.5 g 次甲基蓝，用水溶解并稀释至1 L。

乙液：称取50 g酒石酸钾钠、54 g氢氧化钠、4 g亚铁氰化钾，用水溶解并稀释至1 L。

1.0g/L葡萄糖标准溶液：准确称取已烘干的无水葡萄糖1.0g，用水溶解，加5 mL 浓盐酸（防腐），用水稀释至1 L。

20 g/L 淀粉溶液：称取10.00 g 预先于100～105 ℃烘干2 h 的可溶性淀粉，用水调成糊状，不断搅拌下注入400 mL 的沸水，继续煮沸至透明，冷却后，500 mL 容量瓶中定容至刻度，摇匀。此溶液必须现配现用，若用量较小，可按比例适当减少配制。

1.1.3 仪器设备

超净操作台，上海智城分析仪器制造有限公司；生化培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司；压力蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有限公司；摇床，上海知楚仪器有限公司；紫外/可见分光光度计，翰艺仪器（上海）有限公司；电子天平，奥豪斯仪器（常州）有限公司；pH 计，奥豪斯仪器（常州）有限公司等。

1.2 试验方法

1.2.1 水分、糖化力测定

按照QB/BGJ5.01—-2014《制曲检测方法》测定。

1.2.2 酶活测定[4]

1.2.2.1 待测酶液的制备

称取10.00 g 大曲粉，用少量磷酸缓冲液充分溶解，40 ℃水浴锅中浸取2 h，每隔15 min 搅拌一次（保证酶液完全浸取出来，并将大曲自身的淀粉消耗殆尽）。将上清液倾入容量瓶中，若有剩余残渣，加少量磷酸缓冲液充分研磨,最终样品全部移入100 mL 容量瓶中，磷酸缓冲液定容至刻度，摇匀。用四层纱布过滤,滤液待用。

1.2.2.2 制作淀粉溶液浓度梯度与吸光度的标准曲线

淀粉标准溶液的制备：称取1.50 g淀粉，定容至250 mL容量瓶中。制作淀粉浓度为0 g/L、0.075 g/L、0.15 g/L、0.30 g/L、0.45 g/L、0.60 g/L、0.90 g/L 的标准溶液，测定其在660 nm 处的吸光度，制作淀粉浓度与吸光度标准曲线。

图1 淀粉浓度对应吸光度标准曲线

1.2.2.3 测定

吸取10.0 mL 可溶性淀粉溶液、10 mL 无菌水、5 mL 磷酸缓冲溶液于150 mL 三角瓶中，摇匀后，置于60 ℃的恒温水浴中预热8 min。加1.00 mL 稀释好的待测酶液立即计时，摇匀，准确反应10 min。用自动移液器吸取1.00 mL 反应液（空白对照样加入1.00 mL 磷酸缓冲液），加到预先盛有0.5 mL 盐酸溶液和5.00 mL稀碘液的试管中，摇匀，以0.5 mL盐酸溶液和5.00 mL 稀碘液为空白，于660 nm 波长下,测定其吸光度(A)。

根据标准曲线的公式y=0.8475x-0.0145，假设y0为空白对照样淀粉浓度，y 为待测样淀粉浓度。代入公式计算反应过程中淀粉的消耗量，y0-y=0.8475(x0-x），根据α-淀粉酶活力定义计算α-淀粉酶活力X：

式中：X——样品的酶活力，u/mL；

c——测试酶样浓度，u/mL；

v——反应中加入待测酶液量，mL；

t——反应时间，min。

式中c=0.1 g/mL；v=1.00 mL；t=10 min。

1.2.3 微生物计数称取10 g 处理好的高温大曲曲粉，置于装有90 mL 无菌水的三角瓶中，120 r/min 摇床，振荡15 min左右，使曲粉充分混匀。在无菌操作台上，进行梯度稀释，吸取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度溶液100 μ L，涂布于孟加拉红平板和琼脂计数平板。28 ℃倒置培养2～3 d，即可长出细菌和真菌菌落。对培养好的平板进行计数。

2 结果与分析

2.1 白云边高温大曲在贮存过程中部分理化指标变化规律

2.1.1 水分变化情况

由表1 可知，在贮存15 d 和30 d 时，水分不降反升，而且升幅较大。高温大曲在经过45～50 d的培养后，品温逐渐降低至室温接近，曲醅基本干燥。在前一个月的贮存时间内，大曲从外界吸水，增加了大曲含水量；在第2～5 个月，大曲水分趋于稳定，在11 %左右波动。大曲水分随贮存时间的延长变化不大。水分受环境因素影响很大，白云边贮曲库要求通风、防潮、防虫，是一个相对稳定的环境，所以水分变化不大。

表1 大曲水分随贮存时间的变化情况(%)

2.1.2 酸度变化情况

由表2 可知，大曲酸度随贮存时间的延长有轻微波动，但变化不大，维持在一个相对稳定的水平。

表2 大曲酸度随贮存时间的变化情况(%)

2.1.3 糖化力变化情况

由图2 可知，刚出培菌房的大曲糖化力都很低，随着贮存时间的延长，糖化力逐渐增加，当贮存时间达到90 d时，糖化力达到最大值。后期随着贮存时间的延长，糖化力呈现缓慢下降的趋势。在150 d的贮存期内，糖化力先增后减。

图2 贮存过程中高温大曲糖化力变化情况

2.1.4 酶活变化情况

由图3 可知，大曲酶活与糖化力变化规律一致，先增加后减少，90 d 为转折点。相对于4 班和5班，6班的酶活相对较小，与糖化力情况相同。

图3 贮存过程中高温大曲酶活变化情况

2.2 微生物计数

2.2.1 细菌总数

由表3 可知，在150 d 的贮存期内，大曲中细菌数量逐步降低。刚出房时细菌含量为107CFU/g，贮存150 d 时，细菌含量为105CFU/g，细菌含量逐步下降。在贮存过程中，白云边贮曲库要求通风、防潮,大曲含水量变化不大，故细菌数量逐步下降。

表3 贮存过程中高温大曲细菌总数 (CFU/g)

2.2.2 霉菌总数

由表4 可知，霉菌数量随贮存时间先增加后降低。刚出房的大曲中霉菌含量很少，培菌房内高温抑制了霉菌生长。在成曲库贮存15 d后，曲库温度为室温，适于霉菌生长，霉菌成数量级的增长，后增长放缓。4 班和6 班在75 d 时，霉菌数量达到最大值，5 班在90 d 时，霉菌数量达到最大值。后随着贮存时间的延长，霉菌数量逐渐减少。霉菌数量与糖化力和酶活变化规律一致，呈正相关性。

表4 贮存过程中高温大曲霉菌数量 (CFU/g)

3 结论

研究表明，在高温大曲5 个月的贮存时间内，随着贮存时间的延长，水分变化不大，酸度维持在一个稳定水平，糖化力和酶活先增加后减少，微生物方面，细菌逐步减少，酵母菌难以检测到，霉菌先增加后减少。

大曲水分受曲库环境影响，曲库要求通风，防潮，防虫，所以变化不大。但曲库相对于培菌房来说很干燥，不利于细菌富集，细菌含量不断下降。培菌房内高温抑制了霉菌生长，大曲出房后，曲库中温度更利于霉菌生长，霉菌贮存前期增长迅速，后面有所下降。

大曲中的酸度有两大来源，最主要的是醋酸菌和乳酸菌代谢产生的醋酸和乳酸，其次，脂肪、淀粉和蛋白质的降解也会产生酸[4]。贮存过程中细菌不断减少，使大曲酸度降低，但微生物不断生长繁殖的过程中产生的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等会水解淀粉、蛋白质和脂肪产生酸，所以大曲酸度维持在一个相对稳定的状态。

细菌数量逐步减少，与大曲储存是减少产酸菌数量的认知是一致的[5]。大曲的储存时间越长，细菌含量越少，在酿造发酵过程中可以避免酒醅产生过多的酸。在贮存过程中，大曲糖化力和酶活与霉菌数量成正相关性，都是先增后减，验证了糖化力看霉菌的说法。糖化力、酶活、霉菌数量的转折点是90 d，3个月后，糖化力、酶活、霉菌数量均逐步下降。储存时间越长，大曲糖化力、酶活、霉菌数量越低，不利于发酵。大曲贮存时间最长不应超过一年，贮存时间过长影响窖内发酵，同时增加曲虫危害和曲库成本。储存时间低于3 个月的大曲，细菌含量高，一般不用于生产。在实际生产中，白云边一般选用贮存3～6 个月的大曲用于酿造生产，大曲质量较高。