乔瑞君，郑华月，陈中慧

神经母细胞瘤(NB)是儿童较为常见的神经系统恶性肿瘤，其发病率在世界范围内呈增长趋势[1]。NB的治疗方法主要有手术和化疗，但治疗效果不佳，严重影响病人身体健康[2]。NB的发生发展与多种基因的异常表达密切相关，探究NB异常表达的基因及其作用机制，可为该疾病的治疗提供新靶点。长链非编码RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)是两类小分子非编码RNA，均参与调控细胞增殖、分化和凋亡等生命过程，在肿瘤的发生发展中起重要作用[3-4]。研究显示，lncRNA可作为竞争性内源性RNA与miRNA结合，共同影响肿瘤的发生发展[5]。小核仁RNA宿主基因8(SNHG8)是一种lncRNA，参与多种肿瘤发生发展。Song等[6]研究显示，SNHG8在食管鳞癌组织和细胞系中表达明显升高，其高表达与病人的肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期及总生存率密切相关，下调SNHG8表达，通过靶向miR-411抑制核转运蛋白α2表达降低食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡。但目前，SNHG8在NB中的表达及其对NB细胞恶性生物学行为的影响和机制尚未明确。Starbase在线生物软件预测显示，SNHG8可能与miR-411-5p靶向结合。研究显示，miR-411-5p在肝细胞癌[7]和乳腺癌[8]等肿瘤组织或细胞系中呈低表达，其过表达可抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭及诱导肿瘤细胞凋亡，延缓肿瘤发展进程。但目前，miR-411-5p对NB细胞恶性生物学行为的影响及SNHG8能否靶向调控miR-411-5p影响NB的发展进程还未知。因此，本研究首先检测NB组织和瘤旁组织中SNHG8和miR-411-5p的表达水平，并以SK-N-SH细胞为研究对象，观察SNHG8能否靶向调控miR-411-5p影响SK-N-SH细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭，以期为NB的治疗提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 临床资料 选取2017年5月—2019年12月于本院接受治疗的31例NB患儿为研究对象，其中，男17例，女14例；年龄(4.68±1.59)岁；按照国际NB分期系统进行临床分期，Ⅰ期5例，Ⅱ期10例，Ⅲ期16例。纳入标准：术前未进行放疗、化疗等治疗；术后经病理证实为NB。手术采集患儿癌组织和对应的瘤旁组织，液氮保存。本研究经医院伦理委员会批准同意，病人家属知情同意且自愿签署知情同意书。

1.2 细胞和试剂 SK-N-SH细胞系购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清(FBS)购自美国Hycolne公司；RPMI 1640培养基、细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒和双荧光素酶活性检测试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；逆转录试剂盒和聚合酶链式反应(PCR)试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司；Trizol试剂和LipofectamineTM 2000试剂盒购自美国Invitrogen公司；PCR引物、SNHG8小干扰RNA(si-SNHG8)、乱序无意义阴性序列(si-NC)、miR-411-5p模拟物(mimcs)、模拟对照序列(miR-NC)、miR-411-5p抑制剂(anti-miR-411-5p)及抑制剂阴性序列(anti-miR-NC)均购自上海生工生物工程有限公司；Ki67、活化的半胱天冬酶-3(Cleaved-Caspases-3)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体均购自北京中杉金桥生物试剂公司。

1.3 方法

1.3.1 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测SNHG8和miR-411-5p表达 Trizol试剂提取组织中总RNA，微量核酸仪检测其浓度和纯度后，逆转录为cDNA。以cDNA为模板，进行PCR扩增。扩增条件：95 ℃10 min，95 ℃10 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，共35个循环。引物序列：SNHG8正向引物为5′-AGCGCAGTCAGGATATTGGT-3′，反向引物为5′-GCACAA GAGCGACAGAGTAG-3′；miR-411-5p正向引物为5′-CGTACGCTTTATCTGTGACG-3′，反向引物为5′-GTC AAGTCGGTGGAACG-3′；GAPDH正向引物为5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反向引物为5′-GG C TGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；U6正向引物为5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物为5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。SNHG8以GAPDH为内参，miR-411-5p以U6为内参，2-△△Ct法计算SNHG8和miR-411-5p相对表达水平。

1.3.2 细胞培养 复苏SK-N-SH细胞，加入含10% FBS的 RPMI 1640培养基培养。2～3 d更换1次新鲜培养基。待细胞生长密度至80%时，用0.25%胰蛋白酶消化，进行传代培养。

1.3.3 双荧光素酶报告基因实验 PCR扩增含miR-411-5p结合位点的SNHG8的3′UTR序列，同时利用基因定点突变技术将结合位点突变，均克隆至psi-CHECK-2载体，分别构建SNHG8野生型质粒(WT-SNHG8)和突变型质粒(MUT-SNHG8)。分别将SNHG8-WT、SNHG8-MUT与miR-411-5pmimic或miR-NC共转染至SK-N-SH细胞。转染6 h后，更换新鲜培养基。继续培养24 h后，收集细胞并裂解。参照双荧光素酶活性检测试剂盒说明书，检测荧光素酶活性。

1.3.4 细胞转染 SK-N-SH细胞接种于6孔板中，每孔1×105个细胞。待细胞生长密度至60%时，更换为不含FBS的培养基。采用LipofectamineTM2000脂质体法，分别将si-SNHG8(si-SNHG8组)、si-NC(si-NC组)、si-SNHG8与anti-miR-411-5p(si-SNHG8+anti-miR-411-5p组)、si-SNHG8与anti-miR-NC(si-SNHG8+anti-miR-NC组)转染至SK-N-SH细胞。转染6 h后，更换新鲜培养基，继续培养24 h后，收集细胞用于后续实验。

1.3.5 CCK-8法检测细胞增殖 将各组转染后的细胞接种于96孔板中，每孔0.5×104个细胞。同时将未进行转染的SK-N-SH细胞设置为对照组。培养24 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，继续孵育2 h，酶标仪450 nm处测定光密度(OD)值。

1.3.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 将各组细胞接种于24孔板中，每孔2.5×104个细胞。培养24 h后，用胰蛋白酶消化，收集细胞。参照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.3.7 Transwell法检测细胞迁移和侵袭 调整各组细胞浓度为5×104个/mL。迁移实验：Transwell上室加入100 μL细胞悬液，下室加入500 μL含FBS的RPMI 1640培养基。培养24 h后，用多聚甲醛固定，结晶紫染色，倒置显微镜观察，随机选取5个视野计数。侵袭实验：首先在Transwell上室铺Matrigel基质胶，自然晾干后，加入100 μL细胞悬液，后续操作与迁移实验相同。

1.3.8 蛋白质免疫印迹(Western Blot)法检测细胞中蛋白表达 将各组细胞接种于24孔板中，每孔2.5×104个细胞。培养24 h后，用胰蛋白酶消化，收集细胞。RIPA试剂提取细胞中总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，行10%聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳。电泳后，将分离蛋白湿转至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，并于5%脱脂奶粉中封闭，时间1 h。分别置于Ki67、Cleaved-Caspases-3、MMP-2和MMP-9一抗孵育液中，4 ℃孵育过夜。置于山羊抗兔二抗孵育液中，37 ℃孵育1 h。加入化学发光试剂，避光显影后，曝光拍照，Image J软件分析蛋白条带灰度值。

2 结 果

2.1 NB组织与瘤旁组织中SNHG8和miR-411-5p表达水平比较 与瘤旁组织比较，NB组织SNHG8表达水平升高(P<0.05)，miR-411-5p表达水平降低(P<0.05)。详见表1。

表1 NB组织与瘤旁组织中SNHG8和miR-411-5p表达水平比较(±s)

2.2 SNHG8靶向负调控miR-411-5p Starbase在线生物软件预测显示，SNHG8可能与miR-411-5p靶向结合。与共转染WT-SNHG8的miR-NC组比较，共转染WT-SNHG8的miR-411-5p组荧光素酶活性降低(P<0.05)，而共转染MUT-SNHG8的miR-NC组荧光素酶活性与miR-411-5p组比较差异无统计学意义(P>0.05)；与对照组、si-NC组比较，si-SNHG8组细胞中SNHG8表达水平降低(P<0.05)，miR-411-5p表达水平升高(P<0.05)；与si-SNHG8+anti-miR-NC组比较，si-SNHG8+anti-miR-411-5p组细胞中miR-411-5p表达水平降低(P<0.05)。详见图1及表2、表3。

图1 SNHG8与miR-411-5p核苷酸的连续结合位点

表2 荧光素酶活性检测结果(±s)

表3 各组SK-N-SH细胞中SNHG8和miR-411-5p的表达水平比较(±s)

2.3 SNHG8靶向负调控miR-411-5p抑制SK-N-SH细胞增殖 与对照组、si-NC组比较，si-SNHG8组SK-N-SH细胞OD值降低(P<0.05)；与si-SNHG8+anti-miR-NC组比较，si-SNHG8+anti-miR-411-5p组SK-N-SH细胞OD值升高(P<0.05)；而对照组与si-NC组，si-SNHG8组与si-SNHG8+anti-miR-NC组SK-N-SH细胞OD值比较差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表4。

表4 各组SK-N-SH细胞OD值比较(±s)

2.4 SNHG8靶向负调控miR-411-5p诱导SK-N-SH细胞凋亡 与对照组、si-NC组比较，si-SNHG8组SK-N-SH细胞凋亡率升高(P<0.05)。与si-SNHG8+anti-miR-NC组比较，si-SNHG8+anti-miR-411-5p组SK-N-SH细胞凋亡率降低(P<0.05)。而对照组与si-NC组或si-SNHG8组与si-SNHG8+anti-miR-NC组SK-N-SH细胞凋亡率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。详见图2和表5。

图2 流式细胞仪检测各组SK-N-SH细胞凋亡情况

表5 各组SK-N-SH细胞凋亡率比较(±s) 单位：%

2.5 SNHG8靶向负调控miR-411-5p抑制SK-N-SH细胞迁移和侵袭 与对照组、si-NC组比较，si-SNHG8组SK-N-SH细胞迁移和侵袭数降低(P<0.05)；与si-SNHG8+anti-miR-NC组比较，si-SNHG8+anti-miR-411-5p组SK-N-SH细胞迁移和侵袭数升高(P<0.05)；而对照组与si-NC组，si-SNHG8组与si-SNHG8+anti-miR-NC组SK-N-SH细胞迁移和侵袭数比较差异均无统计学意义(P>0.05)。详见图3及表6。

图3 各组SK-N-SH细胞迁移和侵袭情况

表6 各组SK-N-SH细胞迁移和侵袭数比较(±s) 单位：个

2.6 SNHG8靶向负调控miR-411-5p对SK-N-SH细胞中增殖、凋亡、迁移和侵袭相关蛋白表达的影响 与对照组、si-NC组比较，si-SNHG8组SK-N-SH细胞中Ki67、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平降低(P<0.05)，Cleaved-Caspases-3蛋白表达水平升高(P<0.05)；与si-SNHG8+anti-miR-NC组比较，si-SNHG8+anti-miR-411-5p组SK-N-SH细胞中Ki67、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平升高(P<0.05)，Cleaved-Caspases-3蛋白表达水平降低(P<0.05)；而对照组与si-NC组，si-SNHG8组与si-SNHG8+anti-miR-NC组SK-N-SH细胞各蛋白表达比较差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表7及图4。

表7 各组SK-N-SH细胞中Ki67、Cleaved-Caspases-3、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平比较(±s)

3 讨 论

NB恶性程度高，早期易转移[9]。研究NB发生发展的分子机制并寻找有效的治疗策略，是近年来研究的热点问题。lncRNA参与调控细胞增殖、凋亡和迁移等生命活动，与肿瘤发生发展密切相关。作为一种lncRNA，SNHG8在多种肿瘤中异常表达，参与肿瘤的发展进程。研究显示，SNHG8在肝癌组织和细胞株中的表达水平明显升高，其高表达的病人预后较差，下调其表达通过负调控miR-149抑制肝癌细胞增殖、侵袭和肺转移，可能是肝癌的潜在候选标志物和治疗靶标[10]。子宫内膜癌组织中SNHG8表达明显高于正常子宫内膜，过表达SNHG8抑制子宫内膜癌细胞AN3CA增殖，下调其表达则促进Ishikawa增殖，其通过靶向负调控miR-152进而影响肝细胞生长因子受体(c-MET)的表达调节子宫内膜癌细胞的增殖[11]。SNHG8在胃癌组织及细胞系中表达上调，其通过靶向miR-491/PDGFRA轴促进胃癌细胞的增殖和侵袭，可能为胃癌的治疗提供了新策略[12]。SNHG8在胰腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织和正常胰腺组织，其高表达的病人预后较差，可促进细胞增殖和细胞周期进程，抑制细胞凋亡，并降低胰腺癌细胞对化疗药物的敏感性[13]。但目前SNHG8在NB组织中的表达及其对肿瘤细胞恶性生物学行为的影响和作用机制还未知。

本研究首先检测了NB组织和瘤旁组织中SNHG8的表达水平，发现SNHG8在NB组织中的表达明显高于瘤旁组织，提示其也作为促癌基因参与NB的发生发展。细胞增殖紊乱和凋亡受阻是肿瘤发生发展的重要机制，抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡对于肿瘤的治疗具有积极意义[14]。Ki67是细胞增殖的标志性蛋白，其表达水平高低可反映细胞增殖能力[15]。Caspases家族参与细胞凋亡，而Caspases-3是Caspases家族的重要成员，其活化后诱导细胞凋亡[16]。本研究结果显示，下调SNHG8表达可抑制SK-N-SH细胞中Ki67蛋白表达，而促进活化的Caspases-3蛋白表达，表明下调SNHG8表达可抑制SK-N-SH细胞增殖，并诱导细胞凋亡。基质金属蛋白酶是一类可降解细胞外基质和基底膜的酶类，参与调控细胞迁移和侵袭。目前，对MMP-2和MMP-9的研究最为广泛，其表达升高可促进肿瘤细胞迁移和侵袭[17]。本研究结果显示，下调SNHG8表达可降低SK-N-SH细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达，抑制SK-N-SH细胞迁移和侵袭。提示SNHG8可能是NB治疗的潜在分子靶点。

为了进一步探究SNHG8影响SK-N-SH细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的分子机制，本研究通过双荧光素酶报告基因实验和RT-qPCR检测证实了SNHG8在SK-N-SH细胞中负调控miR-411-5p表达。研究显示，miR-411-5p在非小细胞肺癌(NSCLC)组织和细胞中表达相对较低，上调其表达抑制NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭，并促进NSCLC细胞凋亡，阻滞细胞周期进程，可作为NSCLC分子治疗的潜在靶标[18]。但目前miR-411-5p在NB组织中的表达及对肿瘤细胞恶性生物学行为的影响还未知。本研究结果显示，NB组织中miR-411-5p的表达明显低于瘤旁组织，提示miR-411-5p在NB中也发挥抑癌基因作用。本研究还显示，下调miR-411-5p表达可减弱下调SNHG8对SK-N-SH细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，同时降低下调SNHG8对SK-N-SH细胞凋亡的促进作用，与相关研究报道结果[19]一致，表明下调SNHG8通过靶向上调miR-411-5p表达来抑制SK-N-SH细胞增殖、迁移和侵袭及促进细胞凋亡。

综上所述，NB组织中SNHG8呈高表达，而miR-411-5p呈低表达。SNHG8可能通过与miR-411-5p靶向结合并负调控其表达来影响NB细胞系SK-N-SH的增殖、迁移和侵袭能力，并诱导细胞凋亡，SNHG8/miR-411-5p轴可能为NB的靶向分子治疗提供了新靶点。接下来，本研究将进一步探究miR-411-5p靶基因及下游信号通路对NB细胞系恶性生物学行为的影响，并通过动物实验验证SNHG8/miR-411-5p轴在NB中的作用。