蒲继锋，吴雪莲，潘 虎

（1西藏自治区农牧科学院农业质量标准与检测研究所，拉萨 850032；2西藏自治区农畜产品工程技术研究中心，拉萨 850032）

0 引言

牦牛(B.grunniens，Yak)是生活在高海拔地区的哺乳动物，主要分布于中国青藏高原地区，牦牛肉富含人体所必需的多种氨基酸和多不饱和脂肪酸，肉色鲜红，紧密且富有弹性，口味独特[1-3]，属高蛋白低脂肪类天然绿色食品[4-7]。部分研究表明牦牛肉营养成分与当地海拔高度呈正相关性[8]，西藏昌都市类乌齐牦牛散养于平均海拔4500 m的天然牧场中，其营养价值较高，是中国国家地理标志产品[9]。目前，类乌齐牦牛的研究主要集中在种质资源、遗传特性、出肉率、蛋白质、脂肪等方面[10-13]，而有关其脂肪酸的研究较少。脂肪酸是机体主要能量来源之一[14]，主要分为饱和脂肪酸(SFA)、单不饱和脂肪酸(MUFA)和多不饱和脂肪酸(PUFA)。SFA可有效提高人体血液中低密度脂蛋白胆固醇的含量；MUFA对血浆胆固醇水平呈中性作用，具有特殊功能或营养价值[15]；PUFA在降低胆固醇水平、促进新生儿发育、软化血管等方面具有积极功效[16]，主要包括亚油酸(LA)、花生四烯酸(AA)、二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)等。目前，脂肪酸的测定主要以气相色谱法为主，但其分析时间较长、检测效率较低，而气相色谱串联质谱法具有精度好、效率高等特点[17]。为提升西藏牦牛科研的本土化水平，本研究建立了高原条件下的气相色谱串联质谱法测定牦牛肉中37种脂肪酸的高效分析方法。旨在分析西藏昌都市类乌齐县不同乡镇和不同部位牦牛肉脂肪酸的差异，明确类乌齐牦牛肉中脂肪酸的主要特征。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

431份牦牛肉（采集于西藏昌都市类乌齐县的伊日乡、类乌齐镇、桑多镇、卡玛多乡、岗色乡、长毛岭乡）。有机滤膜（0.22 μm，天津市津腾实验设备有限公司）；正庚烷（色谱纯，美国Sigma公司）；95%乙醇（分析纯，成都金山化学试剂有限公司）；盐酸（分析纯，成都市科隆化学品有限公司）；石油醚（分析纯，成都市科隆化学品有限公司）；氢氧化钾（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；三氟化硼-甲醇溶液（15%，上海易恩化学技术有限公司）；甲醇（色谱纯，美国Sigma公司）；氯化钠（分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司）；无水硫酸钠（分析纯，成都金山化学试剂有限公司）；焦性没食子酸（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；37种脂肪酸甲酯标准品（≥99.3%，NU-CHEKPREP公司）。

1.2 仪器与设备

7890B-7000D型气质联用仪（美国安捷伦公司）；HH-2型水浴锅（中国常州德科仪器制造有限公司）；R210型旋转蒸发仪（瑞典布奇公司）

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件 毛细管色谱柱Agilent112-88A7(100m×250 μm×0.2 μm)；色谱柱流量1.0 mL/min；进样口温度250℃ ；分 流 比 10:1；接 口 温度 250℃ ；载气 He(99.999%)；进样体积1 μL。

升温程序：初始温度100℃，保持0.2min；以15℃/min速率升至215℃，保持0.1 min；再以2℃/min速率升至240℃，保持5 min。

1.3.2 质谱条件 溶剂延迟3 min；离子源温度230℃；离子源EI；采集模式：选择离子监测模式(SIM)。

1.3.3 样品前处理 牦牛肉样品采用食品料理机匀浆后称取2.00 g样品于250 mL消解管内，加入50 mg焦性没食子酸，再加入2 mL 95%乙醇、4 mL水和5 mL盐酸溶液混匀，放入80℃水浴中水解60 min，水解完成后加入5 mL的95%乙醇混匀，用20 mL石油醚分2次提取脂肪，吸取醚层至鸡心瓶中旋转蒸发至干，在残留物中加入2.0%的氢氧化钾/甲醇溶液8 mL，连接回流冷凝器，80℃水浴回流进行脂肪酸的甲醇化，直至油滴消失，从回流冷凝器上端加入7 mL 15%的三氟化硼/甲醇溶液，在水浴中继续回流，用少量水冲洗回流冷凝器。从水浴上取下鸡心瓶，冷却至室温，准确加入5 mL正庚烷并振摇2 min，再加入饱和氯化钠水溶液，静置分层后吸取上层提取液2 mL至50 mL离心管中，加入4.0 g无水硫酸钠，振摇后静置5 min，吸取上层溶液过有机滤膜后稀释1000倍上机测定。

1.4 数据处理

试验数据采用SPSS 22.0进行统计分析，采用LSD和Dencan进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 37种脂肪酸的总离子流色谱图

按上述气相色谱串联质谱条件对37种脂肪酸甲酯混合标准工作液进行SIM分析测定，结果显示其气相色谱串联质谱总离子流色谱图干扰较少，37种脂肪酸能够在25min内完成较好的分离（图1），脂肪酸详细信息见表1。

表1 37种脂肪酸甲酯组分信息

续表1

图1 37种脂肪酸甲酯总离子流图

2.2 方法的线性方程、相关系数及检出限

配置质量浓度为0.38、0.76、1.14、1.51、2.27、3.03、7.57 mg/L的脂肪酸溶液，以样品峰面积A为纵坐标，质量浓度C(mg/L)为横坐标，绘制标准曲线（表2），37种脂肪酸在0.38～7.57 mg/L的范围内呈现良好线性关系，其相关系数为0.99900～0.99987，按照3倍信噪比计算仪器检出限，37种脂肪酸的仪器检出限为1.20×10-5～6.19×10-5mg/L。

续表2

2.3 方法的精密度和准确度

在牦牛肉样品中添加0.38、1.14、2.27、7.57 mg/L的37种脂肪酸甲酯混标工作液进行加标回收实验（n=3，表3），结果表明37种脂肪酸甲酯在4种添加水平下的平均回收率为82.1%～99.7%，相对标准偏差值(RSD)为0.8%～7.8%。本研究建立的高原环境下测定类乌齐牦牛肉中37种脂肪酸含量的气相色谱串联质谱法的精密度和准确度能够满足分析需求，分析时间短，可用于大批量样品的测定。

表3 37种脂肪酸甲酯的回收率及相对标准偏差 %，n=3

续表3

2.4 类乌齐不同部位牦牛肉中37种脂肪酸的差异分析

由表4可见，类乌齐牦牛肉中共检测出27种脂肪酸，其中SFA 11种、平均含量为42.53%，MUFA 7种、平均含量为53.27%，PUFA 9种，平均含量为4.21%。5个部位的SFA含量由高到低依次为里脊＞臀部＞前腿＞后腿＞牛腩＞腱子，5个部位的MUFA含量由高到低依次为牛腩＞腱子＞后腿＞前腿＞臀部＞里脊，5个部位的PUFA含量由高到低依次为腱子＞臀部＞前腿＞里脊＞牛腩＞后腿。类乌齐牦牛肉中有10种脂肪酸(C6:0、C8:0、C11:0、C13:0、C15:1、C18:2n6t、C21:0、C22:2、C23:0、C24:1)未检出，C4:0、C15:0、C18:3n6、C22:1n9、C20:3n3、C22:2、C22:6n3等7种脂肪酸在不同部位牦牛肉中无显著性差异，其余20种脂肪酸在不同部位牦牛肉中存在一定的差异。

表4 不同部位牦牛肉脂肪酸差异性分析 %

续表4

2.5 类乌齐不同乡镇牦牛肉中37种脂肪酸的差异分析

由表5可见，多不饱和脂肪酸总量在各乡镇之间存在显著差异，岗色乡含量最高(5.70%)，类乌齐镇含量最低(2.83%)。C18:2n6c在类乌齐镇与长毛岭乡、卡玛多乡有极显著性差异(P＜0.01)；C18:3n6在岗色乡、类乌齐镇与其他乡镇有极显著性差异(P＜0.01)，在伊日乡与其他乡镇有极显著性差异(P＜0.01)；C18:3n3在长毛岭乡、卡玛多乡与其他乡镇有极显著性差异(P＜0.01)；C20:2在伊日乡与桑多镇、卡玛多乡有显著性差异(P＜0.05)；C20:3n6在伊日乡与卡玛多乡有显著性差异(P＜0.05)；C20:3n3在伊日乡与其他乡镇有极显著性差异(P＜0.01)；C20:4n6在卡玛多乡与类乌齐镇、伊日乡有显著性差异(P＜0.05)；C20:5n3在岗色乡与长毛岭乡、卡玛多乡有极显著性差异(P＜0.01)。饱和脂肪酸总量和单不饱和脂肪酸总量在各乡镇之间没有差异。

表5 不同乡镇牦牛肉脂肪酸差异性分析 %

续表5

3 讨论与结论

类乌齐牦牛肉中主要含有27种脂肪酸，其中SFA 11种、MUFA 7种，PUFA 9种。类乌齐牦牛肉的硬脂酸含量均值为21.08%，与甘南牦牛(22.15%)、当雄牦牛(20.20%)、麦洼牦牛(19.82%)相差不大，较种萨牦牛(13.90%)、青海牦牛(13.57%～16.93%)偏高。单不饱和脂肪酸特别是油酸对降低心血管疾病、降低低密度脂蛋白胆固醇和预防动脉硬化等都具有重要意义[18]，而类乌齐牦牛肉中的MUFA含量约为53.27%，其中油酸(C18:1n9c)的含量高达44.47%，均高于种萨牦牛(31.09%)[19]、甘 南 牦 牛 (35.20%)[20]、麦 洼 牦 牛(40.66%)[21]、当雄牦牛(30.55%)[22]和青海牦牛(13.25%～18.83%)[23]。多不饱和脂肪酸有着广泛的功能，对于脂蛋白的平衡、抗心血管疾病以及促进生长发育等多方面起着重要作用[24]，多不饱和脂肪酸在各乡镇之间差异显著，其中岗色乡牦牛肉中含量最高(5.70%)，类乌齐镇含量最低(2.83%)。中国营养学会提出的膳食中n-6与n-3的最佳比值为4:1～6:1，但过高的n-6反而会增加一些疾病的风险[25]，n-6与n-3最佳比值应为4:1，甚至更低为宜。类乌齐牦牛肉中n-6与n-3的平均比值为4.85，在推荐值范围内，其臀部肉和腱子肉的n-6与n-3比值分别为3.20和3.35，均低于4:1的推荐值，说明类乌齐牦牛的臀部肉和腱子肉具有较高的营养价值。本研究仅对一年的类乌齐牦牛肉样本进行了分析，样品数量有限，后续有待开展不同年份间类乌齐牦牛肉主要脂肪酸的变化趋势研究，以便更全面、更精准的评价类乌齐牦牛肉的营养价值。本研究充实了类乌齐牦牛肉脂肪酸的基础研究数据，将有利的促进西藏地区“名、特、优、新”农畜产品的品牌化建设，同时可有效提升类乌齐牦牛肉的精细化屠宰工艺，提高类乌齐牦牛的经济价值，促进类乌齐县农牧民增收致富并推动当地乡村振兴的蓬勃发展。