梁梦夏，刘怡文，孙 蔚，李婉莹，孔金玉，张 宁，周福有

1)河南科技大学临床医学院;河南科技大学第一附属医院 河南洛阳 471003 2)河南省微生态与食管癌防治重点实验室；河南省肿瘤表观遗传重点实验室 河南洛阳 471003 3)河南科技大学附属安阳市肿瘤医院内镜诊疗中心 河南安阳 455000 4)河南科技大学附属安阳市肿瘤医院胸外科 河南安阳 455000 5)河南省食管癌精准防治医学重点实验室 河南安阳 455000

食管癌对人类健康威胁极大，我国90%以上为食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)，目前ESCC患者的生存率仍很低。研究[1]表明，多种病原微生物均可通过长期定植促进肿瘤的发生发展。具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum，Fn)是毒力最强的口腔致病菌之一，与ESCC发生发展密切相关[2]。前期关于Fn感染与ESCC的研究大多集中在肿瘤细胞[3]，而对肿瘤微环境的探讨较少。有研究[4-5]表明多种病原微生物能富集肿瘤微环境中的髓源抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)，协助肿瘤细胞免疫逃逸。本研究将Fn感染的人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)与ESCC细胞共培养，探讨Fn对MDSC的富集效应；通过检测ESCC组织中Fn感染及MDSC浸润情况，分析Fn对MDSC的富集效应与患者临床病理特征及预后的关系，以期为ESCC的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 病例资料选择2016年1月至4月河南科技大学第一附属医院及安阳市肿瘤医院的130例ESCC患者的癌组织石蜡包埋标本。纳入标准：①治疗性ESCC切除术后患者。②术后病理诊断明确为ESCC。③ 病例资料信息完整。④ 术前未接受放化疗和免疫治疗。⑤确诊后随访60个月。130例患者中男81例，女49例；年龄<60岁59例，≥60岁71例；吸烟65例，不吸烟65例；饮酒63例，不饮酒67例；低分化26例，中、高分化104例；有淋巴结转移65例，无淋巴结转移65例；侵及外膜89例，未侵及外膜41例；临床分期为Ⅰ、Ⅱ期74例，Ⅲ、Ⅳ期56例。该研究获得河南科技大学第一附属医院及附属安阳市肿瘤医院伦理委员会审核批准，并于术前获得患者的书面知情同意。

1.2 主要试剂与仪器健康人外周血(实验室志愿者提供)；人ESCC细胞系KYSE150(中国博谷生物科技有限公司)；Fn标准菌株(ATCC 25586，由美国路易斯维尔大学口腔生物实验室捐赠)。Ficoll-Paque密度梯度分离液(美国GE公司)；白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)及CD3单克隆抗体(美国 PeproTech 公司)；RPMI-1640培养基及胎牛血清(美国Gibco公司)；抗CD45/APC-Cy7、抗HLA-DR/FITC、抗CD11b/APC及抗CD33/PE的荧光标记抗体(美国Biolegend公司)；RNAscope试剂盒及16S rRNA特异探针(美国ACD公司)；免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；兔抗Fn抗体(意大利Diatheva公司)；荧光兔二抗(647 nm)、鬼笔环肽(Phalloidin，488 nm)及4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI，405 nm)(美国CST公司)；CD11b、CD33兔抗人单克隆抗体及二抗(美国Abcam公司)；苏木精(武汉谷歌生物有限公司)；甲醛、曲拉通X-100、牛血清白蛋白、二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色液及柠檬酸抗原修复液(中国索莱宝公司)。光学显微镜(日本尼康公司)，共聚焦显微镜(德国ZEISS公司)，流式细胞仪(美国贝克曼公司)，厌氧工作站(美国COY公司)。

1.3 Fn感染KYSE150细胞的免疫荧光法检测于细胞培养箱和厌氧工作站中常规培养KYSE150细胞和Fn，具体方法参照本课题组前期的研究[6]。待KYSE150细胞密度为70%时，选取活力较好的Fn(菌液OD600 nm=1～2)感染KYSE150细胞，感染复数(multiplicity of infection，MOI)=10。感染24 h后加入体积分数4%的甲醛固定1 h，曲拉通X-100通透5 min，50 g/L 牛血清白蛋白封闭30 min。加入兔抗Fn抗体(按照1∶100 稀释)4 ℃孵育过夜，PBS清洗后加入荧光兔二抗孵育1 h，Phalloidin和DAPI染色10 min，甘油封片。共聚焦显微镜下拍照，观察Fn在细胞中的定位。

1.4 Fn对PBMC中MDSC富集影响的流式细胞术检测

1.4.1PBMC的分离和培养 取健康人外周血置于抗凝管，生理盐水稀释，缓慢铺于Ficoll-Paque密度梯度分离液表面，800×g离心20 min，分层后小心吸取白膜层，800×g离心 5 min，PBS洗涤2次，显微镜下观察形态，确定沉淀为PBMC[7]。用含体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基重悬PBMC。

1.4.2细胞分组与处理[6]①取6孔板，每孔加入1×106个PBMC，加入1 000 U/mL的IFN-γ，于37 ℃、含体积分数5%CO2的培养箱中培养24 h。然后加入50 μg/L CD3单克隆抗体、100 kU/L IL-1β和1 000 kU/L IL-2，此为对照组。②取6孔板，每孔加入1×105个KYSE150细胞常规培养。然后加入1×106个PBMC，建立共培养体系，此为KYSE150组。③取6孔板，每孔加入1×106个PBMC常规培养。然后加入1×107个Fn进行感染(MOI=10)，此为Fn组。④取6孔板，每孔加入1×105个KYSE150细胞和1×106个PBMC共培养。然后加入1×107个Fn进行感染，此为KYSE150+Fn组。每组均设3个复孔。

1.4.3MDSC百分比的流式细胞术检测 分别于培养24、48及72 h后，收集各组中的PBMC，并采用抗CD45/APC-Cy7、抗HLA-DR/FITC、抗CD11b/APC及抗CD33/PE荧光标记抗体染色，应用侧向散射光和前向散射光特性的单核细胞形态学门分选出白细胞(CD45+细胞)，并从白细胞中分选出HLA-DR-细胞，最终从CD45+HLA-DR-细胞中分选出CD11b+CD33+的MDSC。具体步骤参照文献[8]。采用Summit 5.3软件分析，计算MDSC百分比。实验重复3次。

1.5 ESCC组织Fn感染和MDSC富集情况

1.5.1ESCC组织Fn感染的RNAscope检测 取常规石蜡包埋的ESCC组织，2.5 μm厚切片，经脱蜡、靶标修复及蛋白酶处理后，Fn探针40 ℃杂交2 h；依次加入显色试剂孵育，苏木精复染后封片。具体步骤参照本课题组前期的研究[7-8]。Fn感染阳性判定标准[9-10]：以细胞质中单独的红色颗粒≥5个为Fn感染阳性细胞；高倍镜(×400)下取5个视野计数阳性细胞和总细胞，阳性细胞数/总细胞数>30%为阳性样本。

1.5.2ESCC组织MDSC富集的免疫组化[11]检测取常规石蜡包埋的ESCC组织， 2.5 μm厚连续切片，取两张切片经脱蜡、水化、抗原修复、过氧化物酶阻断及山羊血清封闭后，分别加入CD11b及CD33抗体(按1∶200 稀释)孵育；PBS清洗后经二抗孵育、DAB显色、苏木精复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明后中性树胶封片。以ECSS组织间质细胞胞膜呈黄或棕色为CD11b或CD33染色阳性细胞。选取5个高倍镜(×400)视野观察、计数。染色强度：无染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞占间质细胞百分比：<5%为0分，5%～为1分，30%～为2分，>70%为3分；两项相加≤3分为阴性，>3分为阳性。两张ESCC组织CD11b和CD33表达同时阳性的为MDSC富集阳性,不满足以上条件的为MDSC富集阴性。

1.5.3结果判定 Fn+MDSC阳性组：同一患者ESCC组织中Fn、CD11b及CD33同时阳性；Fn+MDSC阴性组：不满足以上条件。

1.6 统计学处理采用SPSS 26.0分析。应用2×2析因设计的方差分析探讨与KYSE150共培养及Fn感染对PBMC中MDSC百分比的影响。采用Cohen′s Kappa 检验分析ESCC组织中Fn感染与MDSC富集的一致性。Fn+MDSC阳性组与阴性组ESCC患者临床病理特征的比较采用χ2检验，两组患者生存曲线的绘制及比较采用Kaplan-Meier法及Log-rank检验。采用Cox回归分析ESCC患者预后的影响因素。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 Fn在KYSE150细胞中的定植情况结果见图1，Fn成功感染KYSE150细胞，并定植于细胞质。

图1 Fn感染KYSE150细胞的免疫荧光检测结果

2.2 各组PBMC中MDSC百分比的比较结果见表1。PBMC与KYSE150共培养或感染Fn均可升高PBMC中MDSC百分比，且两者存在协同作用。

表1 各组PBMC中MDSC百分比的比较 %

2.3 ESCC组织Fn感染及MDSC富集情况结果见图2、3。Fn感染阳性的ESCC组织中MDSC大量富集，而Fn感染阴性的ESCC组织中MDSC富集较少。Fn感染与MDSC富集具有较高一致性(表2)。

A:阳性；B:阴性

A1:CD11b阳性；B1:CD11b阴性;A2:CD33阳性；B2:CD33阴性

表2 ESCC组织Fn感染 与MDSC富集的一致性分析 例

2.4 Fn+MDSC阳性组与阴性组ESCC患者临床病理特征比较结果见表3。与Fn+MDSC阴性组比较，Fn+MDSC阳性组中男性、有吸烟及饮酒史者居多，且肿瘤多为低分化、有淋巴结转移、侵及外膜，临床分期多为Ⅲ、Ⅳ期。

2.5 Fn+MDSC阳性组与阴性组ESCC患者预后比较结果见图4。两组生存曲线差异有统计学意义(χ2=8.962，P=0.003)。与Fn+MDSC阴性组患者比较，Fn+MDSC阳性组患者中位生存期缩短。

2.6 ESCC患者预后影响因素的Cox回归分析结果见表4。以ESCC患者的生存时间为因变量，以Fn+MDSC(阳性=1，阴性=0)，性别(男=1，女=0)、年龄(≥60岁=1，<60岁=0)、吸烟(有=1，无=0)、饮酒(有=1，无=0)、分化程度(低分化=1，中、高分化=0)、淋巴结转移(有=1，无=0)、浸润深度(侵及外膜=1，未侵及外膜=0)、临床分期(Ⅲ、Ⅳ期=1，Ⅰ、Ⅱ期=0)为自变量，进行Cox回归分析，结果显示Fn+MDSC阳性是影响ESCC预后的危险因素。

表3 Fn+MDSC阳性组与 阴性组ESCC患者临床病理特征比较 例(%)

图4 Fn+MDSC阳性组与阴性组ESCC患者生存曲线

表4 ESCC患者预后影响因素的Cox回归分析结果

3 讨论

ESCC预后极差，早期诊断困难，中晚期患者5 a生存率极低[12]。Fn为革兰阴性厌氧菌，广泛定植于口腔和消化道，近年来被认定为具有毒性的条件致病菌，其内毒素能抑制免疫应答[13]。有研究[2]表明ESCC组织中Fn的DNA含量高于癌旁组织，且Fn与ESCC临床分期和不良预后密切相关。本研究结果显示Fn成功感染ESCC细胞，并定植于细胞质，提示Fn在ESCC恶性进展中发挥重要作用，但其致病机制尚未完全阐明。

肿瘤的发生发展与其所处的微环境密切相关[14]。MDSC为肿瘤微环境中的重要免疫抑制细胞，是一类骨髓来源的具有免疫抑制功能的HLA-DR-CD11b+CD33+细胞群，在维持机体自身耐受和调控免疫应答中发挥重要作用，可介导肿瘤细胞的免疫逃逸，是肿瘤免疫治疗的主要障碍[4-5]。MDSC的富集与多种肿瘤的临床分期、总生存期、血管生成及远处转移密切相关。中晚期胃癌患者癌组织中MDSC浸润程度高于早期患者，且浸润程度越高，预后越差[15]。结直肠癌和宫颈癌患者外周血MDSC水平的高低与肿瘤分期和转移呈正相关[16-17]。前列腺癌患者外周血及癌组织中MDSC百分比升高可引起化疗抵抗且缩短患者生存期[18]。多种病原微生物均可通过富集MDSC、调控细胞间抑制机制以及分泌免疫抑制分子，重塑肿瘤微环境，削弱机体免疫反应，协助肿瘤细胞逃避免疫监视。乙型肝炎病毒及幽门螺杆菌均可诱导癌组织中MDSC富集，引起CD4+CD8+T细胞亚群比例失调，使机体抗肿瘤免疫失能，导致癌细胞恶性增殖[19-20]。本研究通过建立人外周血PBMC与KYSE150细胞共培养体系，模拟肿瘤微环境，发现与KYSE150细胞共培养或Fn感染均可升高PBMC中MDSC百分比，且两者存在协同作用，提示ESCC免疫微环境和Fn感染的微环境均可富集MDSC，且两者共同作用对MDSC富集效应更显著。

有研究[21]显示Fn可通过富集MDSC招募Foxp3+调节性T细胞、抑制CD4+T细胞，增加肿瘤负荷。Fn还可通过激活Toll样受体4依赖的IL-6/p-STAT3/c-MYC信号通路促进微环境内MDSC极化和肿瘤生长[22]。本研究结果显示ESCC组织中Fn感染与MDSC富集高度一致，说明Fn定植的ESCC组织中MDSC大量富集。与Fn+MDSC阴性组比较，Fn+MDSC阳性组中男性、有吸烟及饮酒史者居多，表明长期吸烟和饮酒可导致口腔环境恶劣，Fn更容易感染并定植，进而富集大量MDSC；肿瘤多为低分化，提示Fn对MDSC的富集与肿瘤的恶性程度有关；多为有淋巴结转移、侵及外膜，临床分期多为Ⅲ、Ⅳ期，提示Fn对MDSC的富集可能促进了ESCC的恶性进展。本研究结果亦显示低分化、有淋巴结转移、侵及外膜、临床分期为Ⅲ、Ⅳ期及Fn+MDSC阳性是影响ESCC预后的危险因素，提示有效清除Fn并抑制MDSC富集可能延长ESCC患者生存时间。

总之，打破Fn在宿主体内持久定植的现状并抑制MDSC富集，对于积极有效延缓ESCC恶性进展并延长患者生存时间具有非常重要的意义。