李海萍, 关 皓，贾志锋，刘文辉, 陈仕勇, 徐美玲, 陈生翠, 严东海, 蒋永梅, 甘 丽，张珈敏, 周青平

(1.青海省青藏高原优良牧草种质资源利用重点实验室，青海大学畜牧兽医科学院，青海 西宁 810016；2.西南民族大学四川若尔盖高寒湿地生态系统国家野外科学观测研究站，四川 成都 610041；3.青海师范大学数学与统计学院，青海 西宁 810016；4.海北州祁连县林业和草原局，青海 祁连 810499；5.四川省草业技术研究推广中心，四川 成都 610000)

川西北高寒区畜牧业以传统天然草地放牧利用为主，受气候变化和超载过牧等因素的影响，天然草地退化严重，生产力急剧降低，限制了该区域畜牧业转型升级。该地区草产品单一、生产方式落后，冷季饲草不足一直是限制其草牧业发展的短板。因此，破解高寒区饲草季节性供应不足、草畜矛盾突出、养殖效益低下、畜产品附加值低等难题，要从根本上提高饲草种植、加工利用技术水平，从而实现生态效益、社会效益和经济效益最大化，并与时俱进发展高寒区草地生态畜牧业。

燕麦(Avenasativa)是禾本科一年生粮饲兼用作物，喜冷凉、耐贫瘠、营养价值高、缓冲能值低，是高寒地区牧民利用“圈窝子”生产“抗灾保畜”优质饲草的主导品种，在高寒地区畜牧业稳定发展中发挥重要作用[1]。传统上，农牧民在夏末秋初刈割牧草，就地晒制青干草，但是燕麦干草制作过程中受不良天气影响，容易出现霉菌滋生、腐烂等现象，造成燕麦营养成分的损失。青贮是以青绿饲草为原料，在厌氧条件下由乳酸菌发酵调制成的优质青粗饲料，可有效的保持原料的干物质、粗蛋白、可溶性碳水化合物等营养成分，降低酸性洗涤纤维等不易被消化的成分，提高饲料的利用率[2]。燕麦本身附生的乳酸菌数量较少，且品种间差异明显[3]，而乳酸菌的种类和数量是决定青贮发酵能否成功的关键因素[4]。加之川西北地区降雨量充沛[5]，燕麦收获时含水量较高、易滋生腐败菌[6]，如何降低水分且快速启动乳酸发酵是当地高品质青贮生产亟待解决的问题。麦麸作为主要的小麦副产品，其干物质、粗蛋白和灰分含量相对较高，粗纤维含量相对较低，与燕麦混合青贮过程中即可以增加蛋白质来源，又可以调节水分，发挥双重作用。随着对优质低成本饲料需求的增加以及资源整合的倡导，农副产品和食品加工副产品越来越受到重视，麦麸在青贮饲料的应用将有效缓解“人畜争粮”的问题[7]。

本研究拟明确自选乳酸菌株生长、产酸特性，通过燕麦裹包青贮评价添加自选乳酸菌和麦麸对燕麦青贮发酵品质和营养品质的影响，为川西北高寒牧区高品质燕麦青贮生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验的青贮原料为燕麦，于2021年7月28日收获于四川省红原县瓦切镇的唐日牦牛养殖农民专业合作社(33°06′N，102°37′E，海拔3 492 m)，刈割时期为开花期。

供试的乳酸菌为植物乳杆菌160(LP160,Lactobacillusplantarum，CGMCCNo.23166，由团队前期筛选)、短乳杆菌248(LB248,Lactobacillusbrevis，CGMCCNo.23167，由团队前期筛选)和商业菌(Commercial inoculants，COM，台湾亚芯生物科技有限公司，活性菌为植物乳杆菌，活菌数为1010cfu·g-1)。麦麸购买自佳惠饲料(河北石家庄)。

1.2 乳酸菌菌株特性测定

1.2.1乳酸菌菌株生长曲线和产酸曲线的测定 活化好的菌株按照5%(v∶v)的接种量接种到MRS液体培养基中，分别放置于37℃和20℃/-5℃两个温度条件下培养36 h，每个处理设置3个重复，每2 h取培养液用酶标仪(赛默飞Multiskan Go，赛默飞世尔科技(中国)有限公司，中国上海)在600 nm下测吸光度值(Optical density,OD)并使用pH计(雷磁pHS-3C，上海仪电分析仪器有限公司，中国上海)测pH，连续测量36 h。

1.2.2乳酸菌菌株绿汁发酵液pH测定 将灌浆期燕麦榨汁，用无菌医用纱布过滤后收集到50 mL灭菌离心管中，对于事先活化好的菌株按照5%(v∶v)接种量接种于绿汁发酵液中，分别放置在37℃和20℃/-5℃(先20℃,12 h后-5℃,12 h反复交替)的培养箱中连续培养60 h，设置3个重复，分别在4,8,16,24,60 h时测量绿汁发酵液的pH。

1.3 燕麦裹包青贮调制

采用双因素试验设计，A因素为麦麸，设2个水平，A0：0%麦麸；A1：30%麦麸。B因素为乳酸菌类型，设4个水平，B0：对照(喷施等量的灭菌蒸馏水)；B1：LP160植物乳杆菌；B2：LB248短乳杆菌；B3：青贮商业菌,共8个处理(表1所示)。

表1 试验处理编号

燕麦于开花期刈割，留茬高度10 cm，切短成2～3 cm左右。分别向单独燕麦原料与燕麦和麦麸以7∶3混合原料上均匀喷洒植物乳杆菌160(LP160)、短乳杆菌248(LB248)和商业菌，按照活菌数为106cfu·mL-1，装入喷壶，以每1 kg原料喷洒30 mL菌液为标准添加，对照添加等量的灭菌蒸馏水。将原料与乳酸菌添加剂充分混匀后放入全自动青贮打捆包膜一体机，制作成50 kg·个-1的裹包青贮，放置当地室内(-8℃～20℃)发酵60 d，每个处理3个重复。待发酵完成后，打开裹包，每个裹包随机取4个点样品，混匀后取20 g青贮样品与180 mL灭菌蒸馏水混合在4℃冰箱中静置24 h制作浸提液用于测定pH、氨氮(NH3-N)、有机酸。取约300 g样品在65℃烘箱(电热恒温鼓风干燥箱DHG-9053A，上海维菱)中烘干至恒重，粉碎机粉碎，过40目筛后测量相关指标。

1.4 有氧稳定性的测定

青贮60 d后，每个裹包随机在4个点取样，混匀后取1 kg于2 L灭菌烧杯中压实，用两层灭菌纱布覆盖，每个处理3个重复，放置在室温下，连接实时温度记录仪(MT-X，神华科技有限公司，中国深圳)，每5 min测量一次核心区域温度，持续2 d，7 d后取20 g青贮样品与180 mL灭菌蒸馏水混合静置24 h制作浸提液用于测定pH。有氧稳定性的计算基于有氧暴露后青贮饲料核心温度超过基准环境温度2℃所持续的时间[8]。

1.5 测定指标及方法

1.5.1青贮饲料营养成分测定 干物质(Dry matter,DM)含量采用65℃烘箱(电热恒温鼓风干燥箱DHG-9053A，上海维菱)烘干至恒重测定[9]；粗蛋白(Crude protein,CP)含量采用FOSS全自动凯氏定氮仪测定[10]；粗脂肪(Ether extract,EE)含量采用石油醚浸提通风挥发后称重的索氏提取法测定[11]；灰分(Ash)含量采用电炉低温碳化后用马弗炉灼烧测定[12]；中性洗涤纤维(Neutral detergent fiber,NDF)、酸性洗涤纤维(Acid detergent fiber,ADF)含量采用Van Soest法测定[13]；淀粉(Starch)含量采用植物淀粉含量试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司，中国苏州)测定。水溶性碳水化合物(Water soluble carbohydrates，WSC)采用植物可溶性糖含量试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司，中国苏州)测定含量。

1.5.2青贮发酵特性测定 pH采用pH计(雷磁pHS-3C，上海仪电分析仪器有限公司，中国上海)测定；氨态氮(NH3-N)含量通过浸提液处理后采用苯酚-次氯酸钠法测定[14]；有机酸包括乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PA)、丁酸(BA)，采用超高效液相色谱仪(赛默飞UltiMate3000,美国)测定其含量，将浸提液通过0.22 μm滤头过滤到进样瓶中，色谱条件为：RSpak KC-811色谱柱，流动相0.1% H3PO4，流速0.5 mL·min-1，柱温55℃。

1.6 统计分析

采用Excel 2016和SPSS 26.0进行数据统计分析，先利用Excel2016对数据进行预处理，再利用SPSS 26.0进行双因素方差分析，再结合邓肯氏(Duncan′s)方法进行处理间多重比较，其中P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌菌株生长曲线和产酸曲线的测定

由图1可见，恒温37℃条件和反复冻融条件下，菌株的生长曲线呈现不同的变化趋势。37℃条件下，菌株LP160和LB248快速生长，在14 h时进入稳定期而商业菌生长缓慢且OD值始终小于LP160和LB248。在冻融条件下菌株均生长缓慢且在-5℃时出现了明显的停滞期，温度重新升到20℃时菌株再次恢复生长，商业菌生长缓慢且OD值低于LP160和LB248。在两个处理条件下LB248菌株表现出了较快的生长速度菌株的产酸曲线与生长曲线呈负相关(图2)，菌株LP160和LB248表现出相似的变化趋势。37℃条件下，菌株LP160和LB248的pH迅速下降，在14 h时降到最低，商业菌pH下降缓慢且pH始终高于LP160和LB248，LP160、LB248和商业菌的最终pH分别是3.45，3.55和3.79。冻融条件下，pH下降较缓慢，在-5℃阶段出现了停滞期，温度切换到20℃阶段时pH继续下降，商业菌的pH始终高于LP160和LB248，LB248，LP160，LB248和商业菌的最终pH分别是3.90，3.84和4.38。

图1 乳酸菌菌株不同温度下的生长曲线

图2 乳酸菌菌株不同温度下的产酸曲线

2.2 乳酸菌菌株在冻融条件下的绿汁发酵液测定

如图3所示，在冻融条件下将菌株接种到燕麦绿汁发酵液后，各菌株表现不同，LB248和商业菌的pH在前24 h下降极少，而LP160下降较快，经过24 h发酵后，接种LP160的绿汁发酵液pH已降低到4.13，而LB248和商业菌接种的绿汁发酵液pH分别是5.64和5.83。60 h后，接种LP160LB248和商业菌的绿汁发酵液的pH分别是3.91,4.04和4.38，商业菌的pH高于LP160和LB248的pH。

图3 接种乳酸菌菌株后燕麦绿汁发酵液pH曲线

2.3 青贮原料特性

青贮前新鲜燕麦的干物质含量为23.69%鲜重(Fresh weight,FW)，粗蛋白为10.02% DM，中性洗涤纤维为52.17% DM，酸性洗涤纤维为30.69%，水溶性碳水化合物为7.89% DM。附生的乳酸菌、肠杆菌、酵母菌和霉菌分别为3.45，3.19，2.56，3.29 log cfu·g-1FW(表2)。

表2 燕麦青贮原料特性

2.4 麦麸和乳酸菌协同作用对燕麦青贮品质的影响

表3可知，A0B0的pH极显著高于其他处理组(P<0.01)，A1B0的pH极显著高于A1B1，A1B2，A1B3(P<0.01)，说明接种乳酸菌显著降低了燕麦青贮的pH。A0B1，A0B2，A0B3的pH均低于A1B1，A1B2，A1B3，可见添加麦麸后，接种乳酸菌pH降低较少。A0B1，A0B2，A0B3的NH3-N/TN含量均极显著低于A1B1，A1B2、A1B3(P<0.01)，其中A0B1的NH3-N/TN含量均极显著低于其他处理组(P<0.01)。A0B1的乳酸含量极显著高于其他处理，A1B0的乙酸含量均极显著高于其他处理(P<0.01)。因此,A0B1的发酵特性最优。由双因素方差分析可见，pH，NH3-N/TN和乙酸的含量与麦麸和乳酸菌及其交互作用均显著相关(P<0.05)，而乳酸含量与麦麸无相关性。

表3 麦麸和乳酸菌互作对燕麦青贮发酵品质的影响

表4可知，A1B0，A1B1，A1B2和A1B3的DM，CP含量均极显著高于A0B0，A0B1，A0B2和A0B3(P<0.01)，其中A1B1的DM、CP和淀粉含量最高，极显著高于其他处理(P<0.01)。A0B0的WSC含量低于其他处理组，而A0B1的WSC含量最高。A1B1的NDF、ADF均低于其他处理，而A1B2的ADF和NDF最高；由此可见，麦麸和乳酸菌共同作用对燕麦青贮营养品质影响大，添加麦麸后干物质和粗蛋白含量显著增加(P<0.01)，其中A1B1提高燕麦青贮营养品质效果最为明显。根据方差分析可知，除灰分、粗脂肪、可溶性碳水化合物外，其余营养指标与麦麸、乳酸菌及麦麸和乳酸菌互作都显著相关(P<0.05)，可溶性碳水化合物与乳酸菌极显著相关(P<0.01)，与麦麸和乳酸菌互作显著相关(P<0.05)。

表4 麦麸和乳酸菌互作对燕麦青贮营养品质的影响

2.5 添加麦麸和乳酸菌对燕麦青贮有氧稳定性的影响

经有氧暴露两天后，各个处理的pH如图4所示，A1B2处理的pH最高，A0B1处理的pH最低，添加麦麸后燕麦青贮的pH显著降低(P<0.05)。在不添加麦麸条件下，接种LP160和LB248显著降低燕麦青贮pH；添加麦麸后LP160和商业菌显著降低pH(P<0.05)。因此，无论添加麦麸与否，接种LP160的燕麦青贮有氧暴露阶段的pH都显著低于对照。

图4 麦麸和乳酸菌互作对燕麦青贮有氧暴露两天后pH的影响

如图5所示，通过有氧暴露实验确定了有氧稳定性时间，接种乳酸菌和麦麸后有氧稳定性显著增加(P<0.05)，A0B1>A1B1>A0B2>A1B3>A1B0>A0B0>A0B3>A1B2，其中LP160 效果最优，是对照的近2倍。LB248在不加和添加麦麸后有氧稳定性时间分别是127.33 h和55.67 h。所有处理的有氧稳定性均超过了2 d。

图5 麦麸和乳酸菌互作对燕麦青贮有氧稳定性的影响

3 讨论

3.1 乳酸菌对燕麦青贮和有氧稳定性的影响

乳酸菌是有利于青贮保存的微生物，它在厌氧条件下发酵水溶性碳水化合物并产生乳酸，降低pH，从而抑制其他有害微生物的生长[15]。本研究单独接种自选乳酸菌明显改善发酵品质，且有氧暴露两天后，pH仍维持在5.0以下，尤其LP160效果最优，有氧稳定性显著高于其他处理，自选乳酸菌效果均优于商业菌，这就说明虽然乳酸菌具有革兰氏阳性，不产生孢子，过氧化氢酶阴性，耐酸，喜欢在厌氧条件下生长等共同点[16]，但是由于环境的不同，附生植物的不同，不同的菌株有不同的特性[17-19]，而因地制宜筛选出的乳酸菌作用更优，这与张红梅等[20]的研究结果一致。根据乳酸菌对碳水化合物的代谢，将其分为同型发酵乳酸菌和异型发酵乳酸菌，前人研究发现与未经处理的对照相比，接种植物乳杆菌和布氏乳杆菌提高了乳酸菌和乳酸的含量，降低了pH值和丁酸、2，3-丁二醇及乙醇的水平，提高了发酵品质且抑制了有氧变败的发生[21-22]，这与本研究结果一致。但是，有氧暴露两天后，LP160处理的pH显著低于LB248处理，这与前人[21,23]研究的异型发酵乳酸菌更有利于有氧稳定性的结果不一致，且LB248与麦麸混合作用时，有氧稳定性反而降低，这可能与菌株特性有关，有待进一步探究。另外，高原上昼夜温差大，青贮期间还会遇到冻融情况[24]，自选菌株LP160和LB248即使在20℃/-5℃条件下也能快速生长且产酸，能够在高寒区燕麦青贮中发挥重要作用。

3.2 麦麸对燕麦青贮和有氧稳定性的影响

红原地区燕麦收获季往往降雨量较大，使得青贮含水量较高，而干物质含量是决定青贮能否成功的一个重要因素[25]，干物质含量过低则容易引起梭菌发酵，产生大量丁酸，导致青贮失败。麦麸作为小麦制粉的副产物，产量约占小麦制粉量的20%，且含有粗蛋白质、淀粉、粗脂肪、粗纤维、以及维生素、阿拉伯木聚糖等营养物质[26-27]。而CP,NDF,ADF是评价青贮饲料营养的主要指标，饲料营养成分中粗蛋白含量相对越多，NDF、ADF含量相对越少，饲料营养品质更好[28]。青贮饲料的发酵是否成功也与WSC含量密切相关，是保证青贮饲料发酵成功的必要条件之一[29]。杜昭昌等[30]发现麦麸和鲜玉米秸秆混合青贮的DM、CP、WSC含量比鲜玉米秸秆单独青贮高。本试验结果与上述结果一致，添加麦麸后DM、WSC和CP含量显著增加，NDF和ADF降低，表明添加麦麸可以提高燕麦青贮营养品质。另外，添加麦麸后，pH、氨态氮降低，乳酸和乙酸含量增加，说明麦麸在一定程度上改善了发酵品质，可能是添加麦麸后含水量降低，抑制了杂菌生长，从而起到促进发酵的作用。研究发现高干物质青贮开窖后的有氧稳定性要优于低干物青贮，而本研究中通过添加麦麸降低了含水量，进而增加了有氧稳定性，本文与上述研究结果一致[31]。

3.3 乳酸菌与麦麸互作对燕麦青贮和有氧稳定性的影响

麦麸中的总碳水化合物含量为50%～60%，主要包括淀粉多糖和非淀粉多糖。前者可被畜禽消化吸收以供能，后者作为麦麸中碳水化合物的主要成分，以高聚合态的半纤维素和纤维素形式存在，难以被畜禽消化利用[26]。Spaggiaria等[32]利用鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)菌株对小麦麸皮进行固态发酵，并评估其对生物活性化合物(游离和结合酚酸)和抗氧化活性的影响，发现乳酸菌处理会改变其纤维结构和营养特性。本研究采用乳酸菌和麦麸互作，发现不同菌株的作用不同，LB248提升了发酵品质增加但中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量，而且有氧暴露两天后pH更高，而LP160的效果更好，产生了协同效应，混合使用后营养品质最优，这一方面可能是因为LP160能够分解纤维而LB248不具有这种特性，另一方面可能是不同菌株与麦麸混合有不同的适应比例，而LB248与麦麸混合的比例失衡，造成营养流失。有氧暴露后各个处理的有氧暴露时间均超过了2 d，实践中，裹包青贮从开包到饲喂完成通常最多需要1～2 d，所以添加麦麸和乳酸菌可以保证饲喂品质。

4 结论

本研究通过在燕麦青贮中添加麦麸和自选乳酸菌，发现添加麦麸和乳酸菌都能一定程度的提高燕麦青贮的营养品质和发酵品质，其中，添加LP160和麦麸的燕麦青贮饲料营养品质最优；添加LP160的燕麦青贮饲料发酵品质最优且有氧稳定性最好，因此，建议在生产实践中，条件允许可混合添加麦麸和乳酸菌菌剂；条件有限可单独添加乳酸菌菌剂。