曹亦芹，程碧真，李 州

(四川农业大学草业科技学院，四川 成都 611130)

全球有20%可利用耕地受到盐胁迫的危害[1]，我国盐碱地面积约为9.91×107公顷，占我国可用耕地面积的25%[2-3]。盐胁迫对种子萌发和植物正常生长产生的抑制作用主要体现在两个方面，一是高盐浓度的外部环境与植物自身水势存在水势差，使植物难以吸收水分和代谢所需的营养物质[4-5]；二是植物被迫吸收过量的盐离子(尤其是Na+)，破坏了细胞内离子浓度平衡，造成离子毒害，植物正常生理代谢活动受阻[6-7]。此外，植物受到盐胁迫时会激活体内的抗氧化防御系统，通过提高抗氧化酶活性清除体内过量的活性氧，保护细胞膜完整性；此外植物内渗透调节系统也会适应胁迫，增强细胞的保水能力[8-11]。

白三叶(Trifoliumrepens)又名白车轴草，为豆科(Leguminosae)车轴草属(Trifolium)的多年生草本植物，其叶量丰富、营养价值高、叶形优美且侵占性强，是我国与国外广泛应用的重要牧草和草坪草[11]。草坪草作为城镇绿化必不可少的组成部分，覆盖地表后能减少水分蒸发，从而减轻可溶性盐类在地表的积累[12]。此外，白三叶根部可以与菌根真菌形成共生关系[13]，兼具有保土护坡和生态修复的功能。白三叶喜冷凉湿润气候，属温带草种，耐涝性[14]和耐阴性较好，林下、建筑下均可生长。但是耐旱和耐盐碱能力较差，胁迫消耗了大量植物体内的营养物质，导致牧草产量降低、品质下滑，对观赏草坪的外观也会造成严重威胁，造成草坪观赏性降低、草坪质量下降甚至植株死亡[15]，这限制了白三叶在许多地区的种植和推广利用[16]。刘伟等人的研究表明，盐浓度大于50 mmol·L-1时，白三叶种子的萌发受到严重影响[11]。盐浓度达到100 mmol·L-1时，白三叶种子的发芽率显著降低，只能达到正常条件下萌发水平的一半，这严重限制了白三叶的利用[17]。

除选育耐盐性强的品种外，使用外源添加物质增强植物的耐盐性是常见的研究手段[18]。胺鲜酯(DA-6，Diethyl aminoethyl hexanote)是一类新型植物生长调节剂，具有安全性好[19]和廉价等特性。DA-6为一种高效的细胞分裂素类似物，具有很高的生物活性，能够促进作物生长、生根和增强肥效，提高各种作物的产量和品质。DA-6已应用于多种农作物、果树、林木等。有研究发现，喷施DA-6可以提高小麦(Triticumaestivum)种子活力[20]，也有助于草莓(Fragaria×ananassa)生长，并延缓植株衰老[21]。此外，DA-6的施用可以提高植物对非生物胁迫的抗逆性。有研究发现，20 mg·L-1DA-6提高了茄子(Solanummelongena)幼苗的抗热性[22]。李东霞等[23]研究发现添加少量DA-6后，可以改善椰枣(Phoenixdactylifera)种子盐胁迫下的萌发情况。DA-6浸种前处理可以通过调节植株抗氧化防御能力显著提高白三叶在萌发期的耐铬性[24]。已有大量研究证实DA-6对农作物的生长与萌发具有一定的调节作用，可以增强植物对非生物胁迫的抵抗能力。但目前对DA-6影响盐胁迫下白三叶种子萌发的研究未见报道。大多数植物在幼苗期是最为脆弱的时期，对不利的环境因素异常敏感，种子在萌发与幼苗生长阶段对盐胁迫的适应能力尤为重要[25]。因此，本研究通过测定发芽特性、渗透调节和抗氧化防御等方面，探讨盐胁迫下DA-6浸种前处理能否改善白三叶种子的萌发情况，并对DA-6诱导的耐盐机理进行初步研究，为提高盐胁迫下白三叶的牧草质量与产量寻找有效便洁的新方法，为草坪草在城市绿化的栽培管理中提供新参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料和设计

以白三叶‘海发’品种为研究对象，先进行浸种处理。海发原产于澳大利亚，耐旱性与耐酸铝性较强，广泛应用于人工草地建植和城市绿化[16]。DA-6浸种处理为将种子浸入蒸馏水中1 h，然后浸泡在不同浓度(0，0.1，0.8，2和5 mmol·L-1)的DA-6溶液中2 h；对照为蒸馏水中浸泡3 h。种子浸种前处理后用蒸馏水反复冲洗数次，并将种子表面的水分轻轻擦干备用。选取饱满健康、色泽均匀、大小一致的50粒种子放置于垫有四层滤纸的培养皿中，分别在蒸馏水和100 mmol·L-1NaCl溶液诱导的盐胁迫下发芽7天，每组50粒种子，每个浓度设置5次重复。培养皿放置于培养箱内。筛选出最有效提高种子萌发的DA-6浓度为0.8 mmol·L-1(图1)，之后的试验共设置四个处理：C(蒸馏水浸种+发芽床使用蒸馏水)、C+DA-6(0.8 mmol·L-1DA-6溶液浸种+发芽床使用蒸馏水)、S(蒸馏水浸种+发芽床使用100 mmol·L-1NaCl溶液)、S+DA-6(0.8 mmol·L-1DA-6溶液浸种+发芽床使用100 mmol·L-1NaCl溶液)。每天上午9点更换新滤纸以保证培养皿内盐浓度一致。每天上午9点记录萌发种子数量。

1.2 测定指标与方法

1.2.1种子发芽指标与鲜干重的测定 在种子萌发七天的过程中每天统计种子萌发数量并观察萌发情况，以胚根长度与种子等长视为萌发。在发芽第3天计算发芽势(Germination vigor，GV)，第7天计算发芽率(Germination percentage，GP)。相关公式如下：

并计算发芽指数(Germination index，GI)和平均萌发时间(Mean germination time，MGT)。相关公式如下：

GI=∑Gt/Dt

MGT=∑(Dt×Gt)/∑Gt

其中Gt是浸种t日后的发芽数；Dt是对应的发芽天数。

在种子萌发七天后，每一个处理随机抽取10株完整健全的幼苗，用直尺测量根长度(Root length，RL)与芽长度(Stem length，SL)，并称取其鲜重(Fresh weight，FW)，然后将样品至于105℃烘箱，杀青30 min，接着调至80℃烘干直至恒重，然后测定幼苗干重(Dry weight，DW)。并计算活力指数(Vitality index，VI)[26]。

VI=FW×GI

1.3 统计方法

数据统计和分析使用SPSS 20(IBM，Armonk，NY，USA)，在P<0.05水平进行单因素方差分析(ANOVA)，使用邓肯法(Duncan)进行多组样本间差异显著性分析。采用Origin9制图。

2 结果与分析

2.1 种子萌发特性与表型

不同浓度DA-6溶液浸种下发芽率、发芽势和发芽指数不同,其中0.08 mmol·L-1浓度浸种后的值最高(图1)。盐胁迫下，白三叶种子的发芽势、发芽率、活力指数和发芽指数比起正常条件都显著下降(P<0.05)，但平均萌发时间显著增加(图2)(P<0.05)。盐胁迫显著抑制了白三叶的发芽过程。DA-6浸种处理后盐胁迫下种子的发芽势、发芽率、活力指数和发芽指数显著高于水浸种后盐胁迫下的种子(P<0.05)，但平均萌发时间没有显著差异(图2)(P<0.05)。盐胁迫处理第7天时，DA-6浸种的种子发芽率与水浸种处理的相比提高了53.17%(图2A)。

图1 不同浓度DA-6溶液浸种对种子萌发特性的影响

图2 水浸种或DA-6浸种对种子萌发特性的影响

盐胁迫下DA-6浸种处理使幼苗的根长度提高了52.15%，两个处理的差异显著(图3A)(P<0.05)，同时DA-6浸种处理对盐胁迫下白三叶种子的茎长和鲜干重均有显著性提高(图3B-D)(P<0.05)。值得注意的是在正常条件下，DA-6浸种显著降低了幼苗根长与鲜重(图3A，C)(P<0.05)，但没有影响幼苗的干重(图3D)。

图3 水浸种或DA-6浸种对种子生长的影响

2.2 种子渗透调节

正常条件下DA-6浸种前处理对幼苗中的游离脯氨含量和渗透势无显著影响(图4A，C)，但提高了可溶性糖含量，增幅为14.34%(图4B)(P<0.05)。在盐胁迫下，DA-6浸种前处理显著提高了盐胁迫下白三叶幼苗的渗透势(图4C)，但对可溶性糖和游离脯氨酸的含量没有显著影响(图4A，4B)。

图4 水浸种或DA-6浸种对种子渗透调节的影响

2.3 种子抗氧化防御

盐胁迫显著诱导了白三叶幼苗中超氧阴离子，H2O2和MDA的积累(图5A-D)(P<0.05)。EL在盐胁迫下也显著高于正常条件(P<0.05)。在正常条件下，EL、超氧阴离子、H2O2和MDA含量在两种处理的幼苗之间没有显著性差异(P>0.05)。经过DA-6浸种前处理的种子在盐胁迫下EL、超氧阴离子含量、H2O2含量和MDA含量分别降低了19.39%,26.49%,23.40%和17.24%。

图5 水浸种或DA-6浸种对种子氧化损伤的影响

盐胁迫显著降低了萌发种子中SOD的活性(图6B)(P<0.05)，但显著提高了CAT的活性(图6D)(P<0.05)，对于APX和POD的活性没有显著性影响(图6A，C)(P>0.05)。DA-6浸种前处理显著提高了盐胁迫下APX、SOD和POD的活性，增幅分别为49.1%、33.0%和31.9%(图6A-C)(P<0.05)。在正常条件下，两种前处理幼苗的抗氧化酶活性没有显著性差异(图6A-D)(P>0.05)。

图6 水浸种或DA-6浸种对种子抗氧化酶活性的影响

3 讨论

植物盐胁迫损害的典型症状包括叶片黄化、枯萎和生长抑制等，而在种子萌发阶段，盐胁迫带来的伤害主要表现在降低种子发芽率，抑制胚芽与胚根的生长[7]。研究发现，NaCl浓度大于68.4 mmol·L-1时，白三叶的发芽率整体低于30%，白三叶胚根长度显著降低[34]。这与本研究结果相一致，即盐胁迫降低了白三叶种子的发芽率并显著抑制胚根的生长。已有研究显示，通过化学物质对种子进行浸种前处理是一种促进胁迫条件下种子萌发的有效方法[35]。张明才等[36]研究发现，DA-6+Mo复配剂可以促进甜豌豆(Lathyrusodoratus)干物质积累，提高可溶性糖、可溶性蛋白和氨基酸的含量。本研究中，使用植物生长调节剂DA-6溶液(0.8 mmol·L-1)浸种前处理可显著改善盐胁迫下白三叶种子的萌发情况，显著提高发芽率、发芽势、发芽指数、根长、茎长、鲜重和干重，有效缓解盐胁迫对白三叶种子萌发的抑制作用。然而，在正常条件下外源DA-6却显著降低了根长和鲜重，提高了茎长和干重，这表明DA-6对种子萌发过程中根和茎的调节效应有所不同，但其调节机制仍需进一步研究。

当植物受到盐胁迫时，会经历生理性缺水和单离子的毒性作用。细胞对高浓度Na+的吸收限制了K+的吸收，导致盐胁迫期间的Na+毒性增加并引起其它营养元素的失衡[37-38]。在响应盐胁迫时，植物可以通过积累可溶性糖和游离脯氨酸等有机代谢物或Na+和K+等无机离子降低渗透势，维持自身渗透平衡[39-40]。其中，常见的有机渗透调节物质主要有游离脯氨酸、可溶性糖、甜菜碱等[41]。本研究发现，盐胁迫诱导了游离脯氨酸和可溶性糖的大量积累，同时伴随着渗透势的显著降低。Cheng等[11]研究表明盐胁迫显著增加了白三叶幼苗的可溶性糖、游离氨基酸和游离脯氨酸含量，显著降低了幼苗的渗透势。熊韬等[42]研究表明，甜瓜(Cucumismelo)内的游离脯氨酸和可溶性糖含量随盐胁迫的增强而提升，可溶性蛋白含量降低，甜菜碱在不同品种内有不同的变化趋势。然而，本研究中水浸种和DA-6浸种的种子在盐胁迫萌发过程中可溶性糖含量和游离脯氨酸含量没有显著性差异，但渗透势却有所不同。这可能是在盐胁迫下，除游离脯氨酸和可溶性糖等有机渗透调节物质影响渗透势外，无机离子Na+和K+的吸收和积累也会导致盐胁迫下细胞渗透势显著降低。水浸种的白三叶种子在盐胁迫下是否吸收和积累更多的Na+离子从而导致了更低的细胞渗透势，仍有待于进一步研究。

4 结论

利用DA-6(0.8 mmol·L-1)进行浸种前处理可以改善盐胁迫下白三叶种子的萌发。盐胁迫下，外源DA-6提高了白三叶种子在盐胁迫下的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、茎长和鲜干重。盐胁迫显著诱导了游离脯氨酸和可溶性糖的积累，伴随着显著降低的细胞渗透势。此外，DA-6浸种前处理还可以提高盐胁迫下抗氧化酶(APX、SOD和POD)的活性，增强幼苗的抗氧化防御能力，这有效地缓解了由盐胁迫引起的氧化损伤，从而稳定细胞膜，有利于盐胁迫下白三叶种子的萌发。